Der humane messenger-RNP: Isolierung, biochemische Charakterisierung und modularer Aufbau
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INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1.1 ZUSAMMENFASSUNG 11 1.2
ABSTRACT 13 2. EINLEITUNG 15 2.1 SPLEISSOSOMEN ENTFERNEN INTRONS AUS
PRAEKURSOR-RNAS 15 2.2 DAS SPLEISSOSOM - EINE DYNAMISCHE MOLEKULARE
MASCHINE 17 2.2.1 INTRON-EXON-GRENZEN WERDEN DURCH KONSERVIERTE
SEQUENZEN MARKIERT 17 2.2.2 DIE GRUNDBAUSTEINE DES SPLEISSOSOMS: U
SNRNPS. 18 2.2.3 DAS MODELL DES SEQUENTIELLEN AUFBAUS VON SPLEISSOSOMEN.
19 23 SPLEISSFAKTOREN GEHOEREN UNTERSCHIEDLICHEN PROTEINFAMILIEN AN 21 2.4
DER SPLEISSPROZESS MARKIERT IM KERN GESPLEISSTE MRNA 21 2.5 VERBINDUNG
ZWISCHEN TRANSKRIPTION UND EXPORT: DER TREX KOMPLEX 23 2.5
KERN-CYTOPLASMA-TRANSPORT VON MRNPS 23 2.6 ISOLIERUNG UND
CHARAKTERISIERUNG SPLEISSOSOMALER KOMPLEXE 24 2.6.1 PROTEINE ALS
ZIELMOLEKUELE ZUR AFFINITAETSSELEKTION 24 2.6.2 RNA ALS ZIELMOLEKUEL ZUR
AFFINITAETSSELEKTION 25 2.6.3 MASSENSPEKTROMETRIE: CHARAKTERISIERUNG VON
RNP-KOMPLEXEN 25 ZIELSETZUNG DER DISSERTATION 27 3. MATERIALIEN &
METHODEN 29 3.1 MATERIALIEN 29 3.1.1 CHEMIKALIEN, FEINCHEMIKALIEN UND
MEDIEN 29 3.1.2 NUKLEOTIDE 30 3.1.3 ANTISEREN UND MONOKLONALE ANTIKOERPER
30 3.1.4 DNA OLIGONUKLEOTIDE 30 3.1.5 ENZYME UND ENZYMINHIBITOREN 31
3.1.6 BAKTERIENSTAEMME (ESCHERICHIA COLI) 31 3.1.7 EUKARYOTISCHE
ZELLINIEN 31 3.1.8 HAEUFIG VERWENDETE PUFFER 31 3.1.8.1 ALLGEMEINE PUFFER
31 3.1.8.2 PUFFER ZUR HERSTELLUNG SPLEISSAKTIVER HELA KERNEXRAKTE 31 3.1.
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/993154964 DIGITALISIERT
DURCH INHALTSVERZEICHNIS 3.2.1.8.1 SILBERFAERBUNG VON DENATURIERENDEN
RNA-GELEN 37 3.2.1.8.2 SILBERFAERBUNG VON SDS-GELEN 37 3.2.2
PROTEINBIOCHEMISCHE STANDARDMETHODEN 37 3.2.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON PROTEINEN 37 3.2.2.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DES MBP-MS2
FUSIONSPROTEINS 38 3.2.2.3 DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 38 3.2.3 IMMUNOLOGISCHE
METHODEN 39 3.23.1 AFFINITAETSAUFREINIGUNG VON ANTIKOERPERN 39 3.23.2
IMMUNOBLOT (WESTERN BLOT) 40 3.2.3.3 CO-IMMUNPRAEZIPITATION (CO-IP) 40
3.2.4 ZELLKULTURTECHNIKEN 41 3.2.4.1 KULTIVIERUNG VON BAKTERIENZELLEN 41
3.2.4.2 KULTIVIERUNG VON HELA S3 SUSPENSIONSZELLEN IN FERMENTERN 41
3.2.5 SPEZIELLE METHODEN 42 3.2.5.1 MS2-AFFINITAETSSELEKTION VON IN VITRO
GESPLEISSTEN MRNPS 42 3.2.5.2 PRAEPARATION VON HELA KERNEXTRAKTEN IM
FERMENTERMASSSTAB 42 3.2.53 IN VITRO SPLEISSREAKTIONEN 43 3.2.5.4
GEZIELTER RNASEH VERDAU 43 3.2.5.5 ANALYSE SPLEISSOSOMALER KOMPLEXE AUF
NATIVEN AGAROSEGELEN 43 3.2.6 MASSENSPEKTROMETRISCHE METHODEN 44 3.2.6.1
LIQUID-CHROMATOGRAPHY TANDEM COUPLED MS/MS (LC-MS/MS) 44 3.2.6.2 ION
TRAPPING COUPLED MS/MS (Q TRAP) 44 4. ERGEBNISSE 45 4.1 PROTEINANALYSE
IN VITRO GESPLEISSTER MRNPS 45 4.1.1 ISOLIERUNG VON MRNPS 46 4.1.2
HERSTELLUNG DES ISOLIERUNGSSYSTEMS: RNAS UND FUSIONSPROTEIN 46 4.1.
INHALTSVERZEICHNIS 5.2.2 DDX3 IST EIN BONAFIDE EJC-ASSOZIIERTES PROTEIN
75 5.23 DER THO/TREX KOMPLEX 77 5.2.4 SR- UND HNRNP-PROTEINE 77 5.2.5
KLASSIFIZIERUNG DER NEU IDENTIFIZIERTEN MRNP-SPEZIFISCHEN PROTEINE 77 53
DIE ROLLE DER -20/24 REGION IN DER REKRUTIERUNG VON EJC PROTEINEN 79 5.4
DIE ROLLE DES CBC IN DER REKRUTIERUNG MRNP-ASSOZIIERTER PROTEINE 79
5.4.1 DIE ROLLE DES CBC ALS REKRUTIERUNGSFAKTOR FUER MRNP PROTEINE 79
5.4.2 DIE CBC-ABHAENGIGE REKRUTIERUNG VON ALY/BEF UND UAP56/THO 80 5.4.3
DER CBC: REKRUTIERUNGSPLATTFORM FUER DEN TRANSPORTKOMPLEX TREX 81 5.4.4
CBC-ASSOZUEERTER TREX UND DER EXPORT INTRONLOSER MRNAS 81 5.5
ABSCHLUSSBEMERKUNGEN & AUSBLICK 83 6. LITERATURVERZEICHNIS 85 ANHANG
TABELLEN & ABBILDUNGEN 91 ABKUERZUNGEN 93 -9- |
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