Objektträgerbasierte Zytometrie als Analyseverfahren in Diagnostik und polychromatischer Zellphänotypisierung:
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Göttingen
Sierke
2009
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| adam_text | Titel: Objektträgerbasierte Zytometrie als Analyseverfahren in Diagnostik und polychromatischer Zellphäno
Autor: Mittag, Anja
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis 9
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 13
1.1 Cytomics 15
1.1.1 Cytomics bei klinischen Fragestellungen 16
1.1.1.1 NK- und NKT-Zellen 17
1.1.1.2 Cytomics in der Pharmakologie und Toxikologie 20
1.1.2 Cytomics und das „Human Cytome Project 21
1.2 Objektträgerbasierte Zytometrie 22
1.2.1 Hintergrund 22
1.2.2 Prinzip 23
1.2.3 LSC-Auswertesoftware WinCyte™ 27
1.2.3.1 Mergen 29
1.2.3.2 Kompensation 31
1.2.4 Methodische Grundlagen 31
1.2.4.1 Fluoreszenzschutzmedien 31
1.2.4.2 Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen 32
1.3 Ziel 34
2 MATERIAL UND METHODEN 37
2.1 Analysematerial 37
2.2 Bestimmung des Differentialblutbildes 37
2.2.1 Leukozytenzählung und -differenzierung 37
2.2.2 Erythrozytenzählung 38
2.2.3 Evaluierung der Ergebnisse 38
2.2.3.1 Vergleich mit CELL-DYN 4000 38
2.2.3.2 Verdünnungsreihe 38
2.2.3.3 Intraassayvarianz 38
2.3 NK-/NKT-Zellphänotypisierung mittels
Achtfarbanalyse 39
2.3.1 Präparation des Objektträgers 39
2.3.2 Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern 39
2.3.2.1 Einzelfarbanalyse 39
10 Inhaltsverzeichnis
2.3.2.2 Achtfarbanalyse 40
2.4 Protokolle zu den einzelnen Komponenten der
hyperchromatischen Zytometrie 42
2.4.1 Sequentielle Analyse mittels Filterwechsel 42
2.4.2 Bleichen, Photodestruktion und Photoaktivierung 42
2.5 Filterkonfiguration des LSCs 43
2.6 Qualitätssicherung 43
2.6.1 Bead-Analysen 43
2.6.2 Vergleich der LSC-Analyse mit dem „Golden Standard 44
2.7 Statistik und Datendarstellung 45
2.7.1 Differentialblutbild 45
2.7.1.1 Vergleich mit CELL-DYN 4000 46
2.7.1.2 Verdünnungsreihe 46
2.7.1.3 Intraassayvarianz 46
2.7.2 Polychromatische Zytometrie 47
2.7.2.1 Evaluierung der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe 47
2.7.2.2 Weitere statistische Auswertungen 47
2.7.3 Hyperchromatische Zytometrie 47
3 ERGEBNISSE 49
3.1 Differentialblutbilderstellung 49
3.1.1 Leukozyten 49
3.1.2 Erythrozyten 52
3.1.3 Evaluierung der Ergebnisse 52
3.1.3.1 Vergleich der Ergebnisse mit denen des Routinelabors 52
3.1.3.2 Verdünnungsreihe 53
3.1.3.3 Intraassayvarianz 54
3.2 Polychromatische Zytometrie 55
3.2.1 Fluoreszenzschutzmedium 55
3.2.2 Evaluierung der Merge-Funktion 57
3.2.3 Einzelfarbanalyse 58
3.2.3.1 Resolutionparameter 59
3.2.3.2 Relative Helligkeit 61
3.2.3.3 Spillover-Matrix 61
3.2.4 Vergleich mit FCM 64
Inhaltsverzeichnis 11
3.2.5 Analyse mittels Mergen und Filterwechsel 66
3.2.6 Achtfarbanalyse zur Charakterisierung von NK- und NKT-
Zellen 68
3.3 Komponenten für die hyperchromatische Zytometrie 73
3.3.1 Bleichen 73
3.3.2 Messung mehrerer Fluoreszenzen in einem Detektionskanal 75
3.3.3 Photodestruktion 77
3.3.4 Photoaktivierung 79
4 DISKUSSION 81
4.1 Erstellung eines Differentialblutbildes 81
4.2 Polychromatische Zytometrie für die Zellanalyse 84
4.2.1 Methode 85
4.2.2 Datenanalyse 86
4.2.2.1 Spillover 87
4.2.3 Immunphänotypisierung 88
4.2.3.1 NK-Zellen 89
4.2.3.2 NKT-Zellen 90
4.2.3.3 NK-/NKT-Zellphänorypisierung 92
4.2.3.4 Polychromatische Zytometrie 94
4.3 Hyperchromatische Zytometrie 95
4.4 Ausblick 99
5 ZUSAMMENFASSUNG 101
6 LITERATURVERZEICHNIS 107
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 125
8 BEGRIFFSERKLÄRUNG 127
9 DANKSAGUNG 129
ANHANG 131
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 131
12 Inhaltsverzeichnis
Persönlicher und wissenschaftlicher Werdegang 133
Lebenslauf 133
Publikationsliste 134
Publikationen in Wissenschaftsjournalen 134
Publikationen in Büchern und CDs 135
Abstracts - Poster 137
Abstracts - Vorträge 141
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