Untersuchungen über die endogene Expression und Regulation des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) in extrathyreoidalen Tumoren in vitro und in vivo:
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Autor: Gärtner, Florian
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung xiii
1 Einleitung 1
1.1 Grundlagen der Radioiodtherapie 1
1.1.1 Schilddrüsenhormonsynthese 1
1.1.2 Isotope zur Diagnostik und Therapie thyreoidaler Erkrankungen . . 2
1.1.3 Radioiodtherapie benigner Schilddrüsenerkrankungen 4
1.1.4 Radioiodtherapie maligner Schilddrüsenerkrankungen 5
1.2 Der Natrium-Iodid-Symporter (NIS) 7
1.2.1 Struktur 7
1.2.2 Funktion 7
1.2.3 Expression 9
1.3 Ziel der Arbeit 10
2 Material und Methoden 11
2.1 Puffer 11
2.2 Medien 12
2.3 Antikörper 12
2.4 Chemikalien 12
2.5 Oligonukleotide und Plasmide 13
2.6 Radionuklide 14
2.7 Zellkultur 14
2.8 Bakterien 15
2.9 Tiermodelle 15
2.9.1 Allotransplantate 15
2.9.2 Transgene murine Modelle des kolorektalen Karzinoms 16
2.10 Anästhesie und Euthanasie 16
2.11 Iodidaufnahme in vitro 17
2.12 Iodidaufnahme in vitro unter Modulation zellulärer Signalwege 19
2.13 Proteinmengenbestimmung 19
2.14 RNA-Präparation 21
2.15 cDNA-Synthese 22
2.16 Photometrische Nukleinsäurebestimmung 22
vi INHALTSVERZEICHNIS
2.17 Konventionelle PCR 23
2.18 Agarose-Gelelektrophorese 23
2.19 Sequenzierung 24
2.20 Real-time PCR 25
2.21 Immunzytochemie 27
2.22 Deglykosylierung 27
2.23 SDS-PAGE, Elektrotransfer und Immunoblotting 27
2.24 Biodistribution in vivo 28
2.25 Szintigraphie in vivo 29
2.26 Genistein-Stimulation in vivo 29
2.27 Statistik 30
3 Ergebnisse 31
3.1 Endogene Iodidaufnahme in vitro 31
3.2 Genexpression des NIS in murinen Zelllinien 3G
3.2.1 Konventionelle PCR 3(
3.2.2 Sequenzierung 37
3.2.3 Real-time PCR 38
3.3 Immunfluoreszenz 40
3.4 Immunoblot 41
3.5 Modulation der Iodidaufnahme in vitro 41
3.6 Modulation der Genexpression des NIS in vitro 44
3.7 Iodidaufnahme in vivo 45
3.8 Modulation der Aktivität des NIS in vivo 48
3.9 NIS-Expression in murinen Modellen des kolorektalen Karzinoms 49
3.10 NIS-Expression in humanen Zelllinien 52
3.11 NIS-Expression in humanen kolorektalen Karzinomen 54
4 Diskussion 57
4.1 Expression des NIS in murinen extrathyreoidalen Tumorzelllinien J
4.1.1 NIS-Expression in der Brustdrüse (EMT6) 57
4.1.2 NIS-Expression in Kolon und Rektum (CMT93) 58
4.1.3 NIS-Expression in Bronchialgewebe (CMT64) 59
4.2 Funktionelle Regulation der NIS-Aktivität 00
4.2.1 cAMP 01
4.2.2 Tyrosinphosphorylierung 03
4.2.3 PPAR7 64
4.2.4 Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase 04
4.2.5 Proteinkinase C 05
4.3 NIS-Expression in extrathyreoidalen Tumoren in vivo 05
4.3.1 Iodidaufnahme in extrathyreoidalen Allotransplantaten 05
4.3.2 Steigerung der NIS-Aktivität durch Genistein in vivo 06
4.3.3 Expression in murinen transgenen intestinalen Tumoren G7
Inhaltsverzeichnis vii
4.4 NIS-Expression in humanen Zelllinien und kolorektalen Karzinomen .... 68
4.5 Ausblick 70
A mRNA und DNA Sequenzen 71
A.l Rattus norvegicus (rNIS) mRNA 71
A.2 Mus musculus (mNIS) mRNA 72
A.3 Homo sapiens (hNIS) mRNA 73
A.4 Vektorkarte pCR2.1 75
B NIS Protein Sequenzen 77
B.l Rattus norvegicus (rNIS) 77
B.2 Mus musculus (mNIS) 77
B.3 Homo sapiens (hNIS) 78
B.4 Protein alignment: rNIS - mNIS 78
B.5 Protein alignment: rNIS - hNIS 79
Danksagung 85
Abbildungsverzeichnis
1.1 Strukturformel L-Thyroxin 1
1.2 Schilddrüsenhormonsynthese 2
1.3 Histologie der Schilddrüse 3
1.4 Beispiel einer ablativen Radioiodtherapie G
1.5 Beispiel einer erfolgreichen Radioiodtherapie bei Metastasen 7
1.0 Struktur des Natrium-Iodid-Symporters 8
3.1 Zelluläre Iodidaufnahme in vitro (%) 32
3.2 Gesamtprotein 33
3.3 Zelluläre Iodidaufnahme in vitro (%//ig) 34
3.4 Inhibition der Iodidaufnahme in vitro durch NaC104 35
3.5 konventionelle PCR mNIS 36
3.6 konventionelle PCR mGAPDH 37
3.7 Transformierte Klone des Sequenzierungsvektors pCR2.1 38
3.8 real-time PCR mNIS 39
3.9 Inimunfluoreszenz EMT6, CMT93 und CMT64 40
3.10 Immunfluoreszenz LLC 41
3.11 Immunoblot EMT6, CMT93 und CMT64 42
3.12 Modulation der Iodidaufnahme in vitro 43
3.13 Modulation der mNIS-mRNA in vitro 44
3.14 Biodistribution 125r in EMT6, CMT93 und CMT64, %ID/g 46
3.15 Biodistribution 125r in EMT6, CMT93 und CMT64, Organ: Blut 47
3.16 Szintigraphie 99mTcOj in EMTG, CMT93 und CMT64 48
3.17 Modulation der NIS-Aktivität in vivo 49
3.18 mNIS-mRNA in murinen transgenen intestinalen Tumoren 51
3.19 hNIS-mRNA in humanen Zelllinien 53
3.20 hNIS-mRNA in humanen kolorektalen Karzinomen 55
4.1 NIS-Regulation in Thyreozyten 61
4.2 NIS-Regulation in EMT6, CMT93 und CMT64 62
4.3 Fehlerwahrscheinlichkeit bei humanen kolorektalen Karzinomen 69
A.l Vektorkarte pCR2.1 76
Tabellenverzeichnis
2.1 Oligonukleotide 13
2.2 Faktoren zur Modulation zellulärer Signalwege 21)
2.3 Zusammensetzung der SDS-Polyaerylamidgele 28
3.1 Auf Iodidaufnahme evaluierte Zelllinien 31
3.2 Biodistribution 125I in EMT6, CMT64 und CMT93, %ID/g 45
3.3 Biodistribution 125r in EMT6, CMT64 und CMT93, Organ: Blut 40
3.4 inNIS-mRNA in murinen Tumoren, Übersicht 50
3.5 inNIS-mRNA in murinen Tumoren, aufgeschlüsselt nach Mutation 50
3.6 hNIS-mRNA in humanen Zelllinien 52
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