Identifikation, Klonierung und Analyse plasmidhomologer Sequenzen im Chromosom des Stammes Scurry Q217 von Coxiella burnetii:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
.
1
2
LITERATUR
.
2
2.1
SYSTEMATIK
DER
RICKETTSIEN
.
2
2.2
COXIELLA
BUMETII
.
2
2.2.1
ALLGEMEINE
EIGENSCHAFTEN
.
2
2.2.2
EPIDEMIOLOGIE
.
2
2.2.3
KRANKHEISBILDER
UND
PATHOMECHANISMEN
.
3
2.2.4
DIAGNOSTIK
UND
THERAPIE
.
4
2.2.5
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
ERREGERS
.
5
2.2.5.1
STOFFWECHSEL
.
5
2.2.5.2
PHASENVARIATION
.
6
2.2.5.3
SPORULATION
.
8
2.2.6
EINTEILUNG
DES
ERREGERS
.
8
2.3
GENOM
UND
GENE
VON
C.
BURNETII
.
9
2.3.1
ANALYSE
DER
GENOMGROESSE
.
9
2.3.2
KLONIERUNG
UND
ANALYSE
VON
C.
BUMETII-GENEN
.
9
2.3.3
PLASMIDE
.
12
2.3.4
C.
BURNETII-PLASMIDE
.
12
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
16
3.1
MATERIAL
.
16
3.1.1
REAGENZIEN
.
16
3.1.2
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
17
3.1.3
LOESUNGEN
.
18
3.1.4
KULTURMEDIEN
.
21
3.1.5
BAKTERIEN
.
22
3.1.6
PLASMIDE
.
23
3.1.7
BAKTERIOPHAGEN
.
23
3.1.8
ENZYME
.
23
3.1.9
SEQUENZIERUNGS-PRIMER
.
23
3.1.10
KOMMERZIELLE
SYSTEME
.
27
3.1.11
GERAETE
.
27
3.1.12
RECHNER-PROGRAMME
.
28
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
3.2
METHODEN
.
29
3.2.1
ISOLIERUNG,
REINIGUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
.
29
3.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
.
29
3.2.1.2
DNA-REINIGUNG
MIT
EINER
IONENAUSTAUSCHER-MATRIX
.
29
3.2.1.3
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
.
29
3.2.1.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
IM
SPEKTRALPHOTOMETER
.
30
3.2.1.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
30
3.2.1.6
PULSFELD-GELELEKTROPHORESE
.
30
3.2.1.6.1
HERSTELLUNG
VON
AGAROSEBLOECKCHEN
.
31
3.2.1.6.2
CHEF-PFGE
.
31
3.2.1.7
DNA-PRAEZIPITATION
.
31
3.2.1.7.1
ETHANOL-PRAEZIPITATION
.
32
3.2.1.7.2
ISOPROPANOL-PRAEZIPITATION
.
32
3.2.1.7.3
BUTANOL-PRAEZIPITATION
.
32
3.2.1.8
HPLC-REINIGUNG
.
32
3.2.2
DNA-ANALYSEN
.
32
3.2.2.1
DNA-SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
32
3.2.2.2
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG
.
33
3.2.2.2.1
HERSTELLUNG
BIOTIN-MARKIERTER
DNA-SONDEN
.
33
3.2.2.2.2
DOT-BLOT
.
33
3.2.2.2.3
DOWNWARD-BLOT
.
33
3.2.2.2.4
HYBRIDISIERUNG
UND
NACHWEIS
.
34
3.2.3
METHODEN
ZUR
IN
VITRO-REKOMBINATION
.
34
3.2.3.1
PLASMIDE/PHAGEMIDE
.
34
3.2.3.1.1
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
3.2.3.1.1.1
SILICAMATRIX-METHODE
.
35
3.2.3.1.1.2
GELASE-METHODE
.
35
3.2.3.1.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
FREIER
5'-DNA-ENDEN
.
35
3.2.3.1.3
DNA-LIGATION
.
36
3.2.3.1.4
TRANSFORMATION
IN
E.
COLI-ZELLEN
.
36
3.2.3.1.4.1
HERSTELLUNG
VON
TRANSFORMATIONSKOMPETENTEN
E.
COLIOE
ZELLEN
NACH
MANDEL
UND
HIGA
(CAC12-METHODE)
.
36
3.2.3.1.4.2
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/I-STAEMMEN
MIT
PLASMIDEN
.
36
3.2.3.1.5
SELEKTION
REKOMBINANTER
BAKTERIENKLONE
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
3.2.3.1.6
ANZUCHT
UND
SICHERUNG
VON
BAKTERIENKLONEN
.
37
3.2.3.2
PHAGEN
.
37
3.2.3.2.1
PHAGEN-KULTUR
.
37
3.2.3.2.1.1
PHAGEN-VERMEHRUNG
AUF
NAEHRBODENPLATTEN
.
37
3.2.3.2.1.2
VORBEREITUNG
DER
WIRTSZELLEN
.
38
3.2.3.2.1.3
LIGATION
VON
LAMBDA-PHAGEN-DNA
.
38
3.2.3.2.1.4
TH-VIFRO-VERPACKUNG
.
39
3.23.2.2
UEBERTRAGUNG
VON
PHAGEN
AUF
MEMBRANEN
("PLAQUE-LIFTING")
.
39
3.23.2.3
HERSTELLUNG
EINES
PHAGENLYSATS
.
40
3.2.4
DNA-SEQUENZIERUNG
.
40
3.2.4.1
PRIMER
.
40
3.2.4.2
SEQUENZIERUNGSREAKTION
.
41
3.2.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
41
3.2.5.1
PROBENVORBEREITUNG
.
.T
.
41
3.2.5.2
HOT-START-METHODE
.
41
3.2.5.3
THERMOCYCLER-PROGRAMME
.
43
4
ERGEBNISSE
.
44
4.1
NACHWEIS
PLASMID-HOMOLOGER
SEQUENZEN
IM
CHROMOSOM
DES
C.
BURNETII-STAMMES
SCURRY
Q217
.
44
4.2
KLONIERUNG
DES
40
KBP-VO/L
-FRAGMENTS
UND
AN
SCHLIESSENDE
ECOR
1
-SUBKLONIERUNG
.
44
4.3
DARSTELLUNG
UND
KLONIERUNG
DER
QPH
1
-HOMOLOGEN
ANTEILE
INNERHALB
DES
170
KBP-WOTL
-FRAGMENTS
.
45
4.4
KARTIERUNG
DER
ECOR
1
-FRAGMENTE
MIT
PCR
.
45
4.5
VERGLEICH
DER
KLONIERTEN
CHROMOSOMALEN
ECORL
FRAGMENTE
AUS
SCURRY
Q2
17
MIT
DEM
QPH
1
-PLASMID
46
4.6
ANALYSE
DER
ERMITTELTEN
SEQUENZDATEN
.
46
4.7
BESTIMMUNG
DER
CHROMOSOMALEN
INTEGRATIONSSTELLE
49
5
DISKUSSION
.
50
5.1
CHROMOSOMALE
INTEGRATIONSSTELLE
.
51
5.2
MUTATIONEN
.
52
5.3
DIE
"CORE"-REGION
.
53
5.4
SCURRY
Q217-SPEZIFISCHE
PCR
.
54
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
56
7
SUMMARY
.
58
8
TABELLEN
.
59
9
ABBILDUNGEN
.
66
10
LITERATURVERZEICHNIS
.
76 |
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