Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Coatomer-Hüllproteinkomplexes nicht-Clathrin-umhüllter intrazellulärer Transportvesikel:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
V
A ZUSAMMENFASSUNG.
1
B EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG
.2
1. SEKRETORISCHER TRANSPORT.2
2. TRANSPORTVESIKEL.
3
3. FUNKTION VON COPI- UND COPII-VESIKELN.5
4. MOLEKULARER AUFBAU VON COPI-VESIKELN UND MECHANISMUS DER
VESIKELBILDUNG.8
5. INTERAKTION VON COATOMER MIT TRANSMEMBRANPROTEINEN.11
6. AUFGABENSTELLUNG.12
C MATERIALIEN UND METHODEN.14
1. MATERIALIEN.14
1.1 ALLGEMEINE PUFFER UND MEDIEN.14
1.2 MATERIALIEN UND BEZUGSQUELLEN.15
1.3 DNA-GROESSENSTANDARD.16
1.4 PROTEIN-MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD.16
1.5 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE.17
1.6 PLASMIDE.17
1.7 PRIMAERANTIKOERPER.18
1.8 SEKUNDAERANTIKOERPER.18
1.9 STERILISATION VON PUFFERN UND MEDIEN.18
2.
ARBEITEN MIT E.COLI.19
2.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E.COLI.19
2.2 TRANSFORMATION VON E.COLI MIT PLASMID-DNA.19
2.3 INFEKTION VON E. COLI MIT M13-PHAGEN.19
2.4 DAUERKULTUREN.20
3. REINIGUNG VON PLASMID-DNA.20
3.1 REINIGUNG DURCH ALKALISCHE LYSE UND ETHANOLFALLUNG.20
3.2 REINIGUNG MIT YYQIAPREP-SPIN"-SAEULEN.21
3.3 REINIGUNG MIT YYQIAGEN-TIP"-SAEULEN.22
4. GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN.22
4.1 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE.22
4.2 POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE.23
4.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.24
5. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEURE-FRAGMENTEN 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
5.1 PRAEPARATIVE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE.24
5.1.1 ISOLIERUNG MIT YYQIAEX II-SUSPENSION".24
5.1.2 ISOLIERUNG MIT YYWHATMAN 3MM".25
5.2 ISOLIERUNG AUS POLYACRYLAMID-GELEN.25
6. ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON DNA.26
6.1 HYDROLYSE MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.26
6.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA AM 5 '-ENDE.26
6.3 PHOSPHORYLIERUNG VON DNA AM 5 '-ENDE.27
6.4 AUFFULLEN UEBERHAENGENDER 5 '-ENDEN.27
6.5 HYDROLYSE UEBERHAENGENDER 3 '-ENDEN.27
6.6 LIGATION.28
7. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).28
7.1 DURCHFUEHRUNG DER PCR.28
7.2 UMKLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN DURCH YYAT-KLONIERUNG".29
7.3 UMKLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN MITTELS GLATTER ENDEN.30
8. SEQUENZIERUNG VON DNA.30
9. EXPRESSION REKOMBINANTER COPS IN
E. COLI.31
9.1 EXPRESSION VON HIS6-COPS IN ANALYTISCHEM MASSSTAB.31
9.2 EXPRESSION VON HIS
6-COPS IN PRAEPARATIVEM MASSSTAB.33
9.2.1 EXPRESSION VON HIS6-COPS UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN.33
9.2.2 EXPRESSION VON HIS6-COPS UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.33
9.3 EXPRESSION VON TRX-SS'-COP IN ANALYTISCHEM MASSSTAB.34
9.4 EXPRESSION VON TRX-SS'-COP IN PRAEPARATIVEM MASSSTAB.34
9.5 AUFSCHLUSS VON E. COLI-ZELLEN.35
9.5.1 AUFSCHLUSS MIT ULTRASCHALL.35
9.5.2 AUFSCHLUSS MIT LYSOZYM.35
9.5.3 AUFSCHLUSS MIT HARNSTOFF.35
9.5.4 AUFSCHLUSS MIT YYFRENCH PRESS".36
10. REINIGUNG REKOMBINANTER COPS DURCH CHROMATOGRAPHIE.36
10.1 CHROMATOGRAPHIE REKOMBINANTER HIS6-COPS AN NI-NTA-AGAROSE.36
10.1.1 KONTINUIERLICHE CHROMATOGRAPHIE.37
10.1.2 DISKONTINUIERLICHE CHROMATOGRAPHIE.37
10.2 CHROMATOGRAPHIE VON TRX-SS'-COP AN DEAE-SEPHAROSE.38
10.3 CHROMATOGRAPHIE VON TRX-SS'-COP AN EINER AFFMITAETSMATRIX.39
11. RUECKFALTUNG DENATURIERTER COPS.39
12. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN.40
13. DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE.40
14. NACHWEIS VON PROTEINEN IN POLYACRYLAMIDGELEN.41
14.1 COOMASSIE-FAERBUNG.41
14.2 SILBERFARBUNG.42
INHALTSVERZEICHNIS
III
15. TRANSFER VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN (WESTERN-BLOT).42
16. NACHWEIS MEMBRANGEBUNDENER PROTEINE. 43
16.1 NACHWEIS MIT PONCEAU S. 43
16.2 NACHWEIS MIT AMIDOSCHWARZ T. 44
16.3 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS MIT ANTIKOERPERN.44
16.3.1 NACHWEIS MIT DIAMINOBENZIDIN.44
16.3.2 NACHWEIS MIT VERSTAERKTER CHEMILUMINESZENS.45
17. BINDUNG REKOMBINANTER COPS AN DMMA-ZERLEGTEN COATOMER.45
18. IMMUNCHEMISCHE METHODEN. 46
18.1 HERSTELLUNG VON ANTISEREN GEGEN REKOMBINANTE COPS.46
18.2 IMMUNPRAEZIPITATION.
18.3 CHARAKTERISIERUNG DER ANTISEREN.47
18.4 REINIGUNG VON ANTISEREN.4G
18.4.1 AMMONIUMSULFATPRAEZIPITATION.48
18.4.2 CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-SEPHAROSE.48
19. BINDUNGSTEST REKOMBINANTER COPS AN SEPHAROSE-GEKOPPELTE PEPTIDE.48
D ERGEBNISSE.
1. UMKLONIERUNG VON COP-CDNAS IN EXPRESSIONSVEKTOREN.50
1.1 UMKLONIERUNG DER SS-COP-CDNA IN PQE30.50
1.2 UMKLONIERUNG DER SS'-COP-CDNA IN PQE31.50
1.3 UMKLONIERUNG DER SS'-COP-CDNA IN PTRXFUS.51
2. EXPRESSION UND REINIGUNG REKOMBINANTER COPS UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN
52
2.1 EXPRESSION VON HIS6-SS'-COP.53
2.2 REINIGUNG VON NATIVEM HIS6-SS'-COP.57
2.3 EXPRESSION VON SS'-COP ALS THIOREDOXIN-FUSIONSPROTEIN.61
2.4 REINIGUNG VON TRX-SS'-COP AN DEAE-SEPHAROSE.65
2.5 REINIGUNG VON TRX-SS'-COP AN EINER AFFINITAETSMATRIX.67
2.6 VERGLEICH DER METHODEN ZUR EXPRESSION UND REINIGUNG VON SS'-COP.69
2.7 EXPRESSION VON HIS6-E-COP.71
2.8 REINIGUNG VON HIS6-E-COP.72
2.9 EXPRESSION VON HIS6-C,-COP.73
2.10 REINIGUNG VON HIS^-COP.75
3. EXPRESSION UND REINIGUNG UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.77
3.1 EXPRESSION VON HIS6-A-COP.77
3.2 REINIGUNG VON HIS6-A-COP.78
3.3 EXPRESSION VON HIS6-SS-COP.79
3.4 REINIGUNG VON HIS6-SS-COP.80
3.5 EXPRESSION VON HIS6-SS'-COP.81
3.6 REINIGUNG VON HIS6-SS'-COP.82
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.7 EXPRESSION VON HIS
6-Y-COP.83
3.8 REINIGUNG VON HIS6-Y-COP.84
3.9 EXPRESSION VON HIS6-5-COP.85
3.10 REINIGUNG VON HIS6-S-COP.86
3.11 EXPRESSION VON HIS6-S-COP.87
3.12 REINIGUNG VON HIS
6-E-COP.88
3.13 EXPRESSION VON HIS6- ^-COP.89
3.14 REINIGUNG VON HIS6--COP.90
4. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ANTISEREN GEGEN
REKOMBINANTE COPS.91
4.1 ANTISERUM GEGEN HIS6-E-COP.91
4.2 ANTISERUM GEGEN HIS
6-^-COP.91
5. RENATURIERUNG REKOMBINANTER COPS.92
6
. EINBAU VON REKOMBINANTEM HIS6-SS'-COP IN REASSOZIIERENDEN COATOMER.94
6
.1 EINBAU VON NATIVEM HIS6-SS'-COP.95
6.2 EINBAU VON RENATURIERTEM HIS
6-SS'-COP.97
7. UNTERSUCHUNG VON COP-COP-INTERAKTIONEN.98
7.1 KOIMMUNPRAEZIPITATION VON HIS
6-SS-COP UND INTERAGIERENDEN COPS.99
7.2 KOIMMUNPRAEZIPITATION VON HIS
6-SS'-COP UND HIS6-E-COP.100
7.3 BINDUNG REKOMBINANTER COPS AN DAS C-TERMINALE PEPTID VON P23.101
7.3.1 BINDUNG EINZELNER REKOMBINANTER COPS.102
7.3.2 BINDUNG VON ZWEIERKOMBINATIONEN MIT Y-COP ALS KOMPONENTE.104
7.3.3 BINDUNGSTEST MIT ALLEN SECHS RENATURIERTEN REKOMBINANTEN COPS.106
7.4 IMMUNPRAEZIPITATIONEN.107
7.5 MODELL EINES TETRAMEREN, P23 BINDENDEN SUBKOMPLEXES.108
E DISKUSSION.HO
1. EXPRESSION UND REINIGUNG LOESLICHER REKOMBINANTER COPS.110
2. EXPRESSION UND REINIGUNG REKOMBINANTER COPS UNTER DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN.112
3. RUECKFALTUNG DENATURIERTER REKOMBINANTER COPS.113
4. FUNKTION VON Y-COP: BINDUNG AN P23.116
5. COP-COP-INTERAKTIONEN.116
6
. AUSBLICK.120
F LITERATURVERZEICHNIS
122 |
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