Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit vom Schwein mittels der Polymerase-Kettenreaktion:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
13
2
SCHRIFTTUM
.
14
2.1
MYKOPLASMEN
.
14
2.2
MYCOPLASMA
HYOPNEUMONIAE
.
19
2.2.1
AETIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
FUER
DIE
ENZOOTISCHE
PNEUMONIE
DER
SCHWEINE
.
19
2.2.2
VERBREITUNG
UND
EPIZOOTIOLOGIE
.
20
2.2.3
PATHOGENESE
.
21
2.2.4
KLINIK
UND
WIRTSCHAFTLICHE
BEDEUTUNG
.
22
2.2.5
PATHOLOGISCHE
UND
HISTOLOGISCHE
VERAENDERUNGEN
.
24
2.2.6
THERAPIE,
PROPHYLAXE
UND
SANIERUNG
.
25
2.2
7
DIAGNOSE
.
28
2.2.7.1
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
.
28
2.2.7.2
ABKLATSCHMETHODE
.
29
2.2.7.3
CAPTURE-ELISA
.
30
2.2.7.4
IMMUNFLUORESZENZTEST
.
30
2.2.7.5
KULTURELLER
NACHWEIS
DES
ERREGERS
.
31
2.2.7.6
DNA-HYBRIDISIERUNG
.
32
2.2.7.7
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
33
2.3
BRONCHOALVEOLAERE
LAVAGE
(BAL)
.
38
2.3.1
BEDEUTUNG
DER
BAL
FUER
DIE
DIAGNOSTIK
RESPIRATORISCHER
ERKRANKUNGEN
.
38
2.3.2
EINSATZ
DER
BRONCHOALVEOLAEREN
LAVAGE
FLUESSIGKEIT
(BALF)
IN
DER
PCR
.
39
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
42
3.1
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
.
42
3.2
GERAETE
UND
HILFSMITTEL
.
45
3.3
LOESUNGEN
.
47
3.3.1
LOESUNGEN
FUER
VERSCHIEDENE
METHODEN
.
47
3.3.2
LOESUNGEN
FUER
VERSCHIEDENE
DNA-EXTRAKTIONSMETHODEN
(3.3.3;
3.3.12;
3.3.13)
.48
3.3.3
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIEN
UND
MYKOPLASMEN
.
48
3.3.3.1
LOESUNGEN
FUER
DIE
ERNTE
DER
MYKOPLASMEN
UND
BAKTERIENZELLEN
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3.2
REAGENZIEN
FUER
DIE
DNA-EXTRAKTION
MIT
DEMNUCLEON
II
DNA-EXTRAKTIONS-KIT
.49
3.3.3.3
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-EXTRAKTION
MODIFIZIERT
NACH
HOLMES
UND
QUIGLEY
(1981)
.
49
3.3.4
LOESUNG
FUER
DEN
IMMUNO-BINDING-ASSAY
(IBA)
.
50
3.3.5
LOESUNGEN
FUER
DIE
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
(1976)
.
50
3.3.6
LOESUNGEN
FUER
DIE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
51
3.3.7
LOESUNGEN
FUER
DEN
WESTERN-BLOT
.
52
3.3.8
LOESUNGEN
FUER
DEN
IMMUNFLUORESZENZTEST
.
53
3.3.9
LOESUNGEN
FUER
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
53
3.3.10
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
54
3.3.11
LOESUNGEN
FUER
DEN
PROTEINASE
K-VERDAU
NACH
CAMPBELL
(1993)
.
55
3.3.12
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-EXTRAKTION
MIT
DEM
QIAAMP
BLOOD-KIT
.
56
3.3.13
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-EXTRAKTION
NACH
MAASS
UND
DALHOFF
(1994)
.
56
3.4
NAEHRMEDIEN
UND
ANTISEREN
.
57
3.4.1
NAEHRMEDIEN
.
57
3.4.1.1
FRIIS-MEDIUM
.
57
3
4.1.2
SELEKTIVMEDIUM
FURA/.
HYOPNEUMONIAE
.
59
3.4.1.3
PH-MEDIUM
MODIFIZIERT
NACH
HAYFLICK
(1965)
.
60
3.4.1.4
SP-4-MEDIUM
.
61
3.4.1.5
BLUTAGAR
.
62
3.4.1.6
NAEHRBOUILLON
(LIEBIGBOUILLON)
.
62
3.4.2
ANTISEREN
.
63
3.4.3
HERSTELLUNG
VON
KANINCHEN-HYPERIMMUNSERUM
GEGENM
HYORHINIS
.
65
3.4.3.1
TIERE
.
65
3.4.3.2
ANTIGENPRAEPARATION
.
65
3.4.3.3
PROTEINBESTIMMUNG
DER
ANTIGENPRAEPARATION
.
65
3.4.3.4
IMMUNISIERUNGSSCHEMA
.
66
3.5
MYKOPLASMEN
UND
BAKTERIEN
.
66
3.5.1
BEZEICHNUNG
UND
HERKUNFT
.
66
3.5.2
KULTIVIERUNG
.
67
3.5.3
BESTIMMUNG
DER
LEBENDKEIMZAHL
.
68
3.5.4
DNA-EXTRAKTION
.
69
3.5.4.1
ERNTE
DER
ZELLEN
.
69
3.5.4.2
DNA-ISOLIERUNG
VON
MYKOPLASMEN
UND
GRAMNEGATIVEN
BAKTERIEN
MIT
DEM
NUCLEON
II
DNA-EXTRAKTIONS-KIT
.
69
3.5.4.3
DNA-ISOLIERUNG
VON
GRAMPOSITIVEN
BAKTERIEN
.
70
3.5.4.4
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
DER
DNA
.
70
INHALTSVERZEICHNIS
3
6
PROBENMATERIAL
.
72
3.6
1
TIERE
.
72
3.6.2
PROBENNAHME
.
76
3
6.2.1
BRONCHOALVEOLAERE
LAVAGEN
(BAL)
.
76
3.6.2.2
LUNGEN
.
76
3.7
KULTURELLE
UNTERSUCHUNG
DER
BALFS
AUF
MYKOPLASMEN
UND
SEROLOGISCHE
DIFFERENZIERUNG
DER
ISOLATE
.
77
3.7.1
KULTIVIERUNG
.
77
3.7.2
IMMUNO-BINDING-ASSAY
(IBA)
.
79
3.7.3
KLONIERUNG
.
79
3.7.4
PROTEINBESTIMMUNG
(MODIFIZIERT
NACH
BRADFORD
1976)
.
80
3.7.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
UND
WESTERN-BLOT
.
80
3.7.5.1
PROBENAUFBEREITUNG
.
80
3.7.5.2
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
.
81
3.75.3
WESTERN-BLOT
.
81
3.7.5.4
AUSWERTUNG
DER
SDS-PAGE
.
83
3.8
NACHWEIS
VON
M.
HYOPNEUMONIAE
IN
LUNGEN
MIT
DEM
INDIREKTEN
IMMUN
FLUORESZENZTEST
.
83
3.9
MOLEKULARBIOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
M.
HYOPNEUMONIAE
IN
BALFS
UND
GESPUELTEN
LUNGEN
MIT
HILFE
DER
PCR
.
84
3.9.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
84
3.9.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
86
3.9.3
AUSWERTUNG
UND
DOKUMENTATION
DER
DNA-ELEKTROPHORESE
.
86
3.9.4
PRIMER
UND
AMPLIFIZIERTES
FRAGMENT
.
87
3.9.5
OPTIMIERUNG
DER
PCR
.
90
3.9.6
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
.
90
3.9.7
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
DER
OPTIMIERTEN
PCR
.
92
3
9.8
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
PROBENAUFBEREITUNG
.
93
3.9.8.1
AUFARBEITUNG
DER
INKUBIERTEN
BALF
.
93
3.98.1.1
UNBEHANDELTE
KULTUR
.
93
3.9
8.1.2
VERDUENNUNG
DER
KULTUR
.
93
3.9.8.1.3
WASCHEN
DES
ZELLPELLETS
MIT
PBS
.
94
3.9.8.2
AUFBEREITUNG
DER
BRONCHOALVEOLAEREN
LAVAGE-FLUESSIGKEIT
(BALF)
.
94
3.9.8.2.1
UNBEHANDELTE
BALF
.
94
3
9.S.2.2
VERDUENNUNG
DER
BALF
.
94
3.9.82.3
PROTEINASE
K-VERDAU
NACH
CAMPBELL
(1993)
.
95
3
,9.8.2.4
AUFKOCHEN
UND
ABZENTRIFUEGIEREN
.
95
INHALTSVERZEICHNIS
3.9.8.2.S
DNA-EXTRAKTION
MIT
DEM
QIAAMP
BLOOD-KIT
.
95
3.9.8.2.OE
DNA-EXTRAKTION
MIT
DEM
NUCLEON
II
DNA-EXTRAKTIONS-KIT
(NUCLEON-KIT)
.
96
3.9.8.2.7
DNA-EXTRAKTION
NACH
MAASS
UND
DALHOFF
(1994)
(CTAB-METHODE)
.
97
3.9.9
EINSATZ
DER
KLINISCHEN
PROBEN
.
98
3.10
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
98
4
ERGEBNISSE
.
101
4.1
KULTURELLER
NACHWEIS
VON
MYKOPLASMEN
IN
DEN
BALFS
UND
SEROLOGISCHE
DIFFERENZIERUNG
DER
ISOLATE
.
101
4.2
IMMUNFLUORESZENZSEROLOGISCHER
NACHWEIS
VONM.
HYOPNEUMONIAE
IN
LUNGEN.
104
4.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
BALFS
UND
SPUELPROBEN
ENTNOMMENER
LUNGEN
AUFA/.
HYOPNEUMONIAE
.
106
4.3.1
ENTWICKLUNG
EINER
PCR
.
106
4.3.1.1
EIGNUNG
DER
PRIMER
.
106
4.3.1.2
OPTIMIERUNG
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
106
4.3.1.3
SPEZIFITAET
DER
OPTIMIERTEN
PCR
.
107
4.3.1.4
VERBESSERUNG
DER
SPEZIFITAET
.
109
4.3.1.5
SENSITIVITAET
DER
OPTIMIERTEN
PCR
.
110
4.3.2
PROBENAUFBEREITUNG:
NACHWEISMOEGLICHKEITEN
UND
NACHWEISGRENZEN
.
112
4.3.2.1
NACHWEIS
VON
M.
HYOPNEUMONIAE
IN
ARTIFIZIELL
INOKULIERTEM
FRIIS-MEDIUM
.
112
4.3.2.2
NACHWEIS
VON
M.
HYOPNEUMONIAE
IN
ARTIFIZIELL
INOKULIERTER
SPF-BALF
.
113
4.3.3
NACHWEIS
VON
M.
HYOPNEUMONIAE
IN
BALFS
UND
SPUELPROBEN
ENTNOMMENER
LUNGEN
MIT
HILFE
DER
PCR
.
116
4.3.3.1
NACHWEIS
VON
AL.
HYOPNEUMONIAE
IN
KULTIVIERTEN
BALFS
.
116
4.3.3.2
NACHWEIS
VONAY.
HYOPNEUMONIAE
IN
BALFS
UND
SPUELPROBEN
VON
ENTNOMMENEN
LUNGEN
.
118
4.4
VERGLEICH
DER
KULTURELLEN,
FLUORESZENZSEROLOGISCHEN
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
NACHWEISMETHODEN
FUER
M
HYOPNEUMONIAE
.
123
5
DISKUSSION
.
128
5.1
ENTWICKLUNG
EINER
PCR
ZUM
NACHWEIS
VON
A/.
HYOPNEUMONIAE
.
128
5.2
PROBENAUFBEREITUNG
ZUM
EINSATZ
IN
DER
PCR
.
132
5.3
UNTERSUCHUNG
VON
FELDPROBEN
.
136
5.4
SCHLUSSFOLGERUNG
UND
AUSBLICK
.
142
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
145
INHALTSVERZEICHNIS
7
SUMMARY
.
147
8
LITERATURVERZEICHNIS
.149
9
ANHANG
.
178
9.1
INHALTSSTOFFE
DER
BALF
.
178 |
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