Etablierung eines Zellkultursystems zur Untersuchung von Osteochondrodysplasien:
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| adam_text | A Inhaltsverzeichnis
A Inhaltsverzeichnis 1
B Abkürzungen 3
C Einleitung 6
1 Klassifikation der Osteochondrodysplasien 6
2 Pseudoachondroplasie und Multiple Epiphyseale Dysplasie 7
2.1 Pseudoachondroplasie (PSACH) 8
2.1.1 Klinische Merkmale der PSACH 8
2.1.2 Radiologische Merkmale der PSACH 10
2.2 Multiple Epiphyseale Dysplasie (MED) 12
2.2.1 Klinische Merkmale der MED 13
2.2.2 Radiologische Merkmale der MED 14
2.3 Klinische und radiologische Aspekte der Differentialdiagnose von PSACH 15
und MED
2.4 Therapie von PSACH/MED-assoziierten Komplikationen 15
2.5 Histologische und ultrastrukturelle Merkmale von PSACH und MED 17
2.6 Genetische Grundlagen von PSACH und MED 18
2.7 Übersicht: Osteochondrodysplasien mit Defekten extrazellulärer 19
Matrixproteine
3 Cartilage Oligomeric Matrix Protein - COMP 20
3.1 COMP - Mitglied der Thrombospondinfamilie 20
3.2 Struktur des COMP-Gens und Sekundär-, Tertiär und 22
Quartärstrukturmerkmale des Proteins
3.3 Posttranslationale Modifikation und Sekretion 23
3.4 Expressionsmuster und extrazelluläre Lokalisation 24
3.5 Effekt der COMP-Mutationen 24
4 Transgene Expression in primären Chondrozyten 27
5 Aufgabenstellung 28
D Material und Methoden 30
1 Material 30
1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 30
1.2 Lösungen und Puffer 30
1.3 Enzyme 30
1.4 Antikörper 31
1.5 Kits 31
1.6 Oligonukleotide 31
1.7 Expressionsvektoren 31
2 Zellkultur 33
2.1 Rahmenbedingungen 33
2.2 Zellen und Kulturmedien 33
2.3 Isolierung boviner artikularer Chondrozyten 33
2.4 Vitalitätsnachweis 34
2.5 Trypsinierung und Passage 34
2.6 Gewinnung serumfreien Zellüberstandes 35
3 Molekularbiologie 35
3.1 Quantifizierung von DNA und RNA 35
3.2 Agarosegelelektrophorese 35
3.3 DNA-Restriktionsverdau 35
3.4 DNA-Isolation aus Agarosegelen 36
3.5 Ligation 36
3.6 Sequenzierung 36
3.7 Herstellung kompetenter Bakterien 36
3.8 Transformation 37
3.9 Isolierung von Plasmiden aus Bakterien 37
3.10 Transfektion von 293-EBNA-Zellen 38
3.11 Transfektion von primären bovinen artikularen Chondrozyten 38
1
A Inhaltsverzeichnis
3.12 RNA-Extraktion 38
3.13 Reverse Transkription 39
3.14 RT-PCR 39
4 Proteinchemie 40
4.1 Allgemeiner Umgang mit Proteinlösungen 40
4.2 UV-Spektroskopische Proteinquantifizierung 40
4.3 Metallionen-Affinitätschromatographie 41
4.4 lonenaustauscherchromatographie 41
4.5 Proteinfällung 42
4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 43
4.7 Coomassie-Färbung der Polyacrylamid-Gele 43
4.8 Western Blot 43
5 Mikroskopie 44
5.1 Immunfluoreszenzfärbung 44
5.2 Interferenzkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie 45
E Durchführung und Ergebnisse 46
1 Isolation und Kultivierung primärer boviner artikularer Chondrozyten 46
1.1 Isolation der Chondrozyten aus hyalinem Knorpel des Schultergelenkes . 46
1.2 Verhalten der Chondrozyten in der zweidimensionalen Mono/ayer-Kultur . 46
2 Rekombinante EGFP-Expression in primären artikularen Chondrozyten . 49
3 Herstellung der Vektoren zur Expression der COMP-Konstrukte 50
4 Rekombinante Expression des Wildtyp-COMP-Konstruktes in 293-EBNA- 54
Zellen
4.1 Transfektion, Selektion von und Expression in 293-EBNA-Zellen 54
4.2 Aufreinigung 57
5 Rekombinante Expression der COMP-Konstrukte in primären bovinen 61
artikularen Chondrozyten
5.1 Nachweis der Transkription des rekombinanten COMP in bovinen 61
Chondrozyten
5.2 Nachweis des rekombinanten COMP im Western Blot 62
5.3 Immunfluoreszenzmikroskopie 65
5.4 Laser-Scan-Mikroskopie (LSM) 69
F Diskussion 70
1 Effiziente transiente plasmidbasierte Transfektion primärer artikularer 70
Chondrozyten
2 Eigenschaften des his-myc-fX-Tags der COMP-Konstrukte 72
3 Auswirkungen der transgenen Expression im Zellkulturmodell 73
3.1 Geringere Sekretion und erhöhte intrazelluläre Konzentration des 74
rekombinanten D469A-COMP
3.2 D469A-COMP liegt intra- und extrazellulär in Form von Pentameren vor . 77
3.3 Veränderungen auf Einzelzellebene durch D469A-COMP bei transienter 79
Expression
4 Ausblick 80
G Zusammenfassung 81
H Literaturverzeichnis 82
I Lebenslauf 96
2
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