Die Rolle der osteogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in der Pathogenese der partikelinduzierten aseptischen Endoprothesenlockerung: eine In-vitro-Studie
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Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis VII
Tabellenverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis IX
1 Einleitung 1
1.1 Vorwort 1
1.2 Prinzipien der Endoprothetik 2
1.2.1 Abriebpartikel 2
1.2.2 Immunantwort des humoralen und zellulären Systems 3
1.2.3 Biokompatibilität 6
1.2.4 Werkstoff Kobaltchrom 9
1.2.5 Abschnitt Biomechanik 10
1.2.6 Übersicht Prothesen 11
1.2.6.1 Prothesenmaterial 11
1.2.6.2 Prothesendesign 11
1.2.6.3 Prothesenverarbeitung 12
1.2.6.4 Prothesenverankerung 12
1.2.6.5 Operationstechnik 14
1.2.6.6 Patientenabhängige Faktoren 14
1.2.6.7 Revisionsgründe 15
1.3 Stammzellen - hMSC 16
1.3.1 Definition Stammzelle 16
1.3.2 Mesenchymale Stammzelle 17
1.3.3 Osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen 20
1.4 Mechanotransduktion - Gesetz von Wolff 22
1.4.1 Umbauprozesse 24
1.4.2 Knochenentwicklung 24
1.4.3 Knochenbestandteile 25
IV
1.4.3.1 Osteoblasten 26
1.4.3.2 Osteoklasten 26
1.4.3.3 Osteozyten 26
1.4.3.4 Bone lining cells 27
1.4.4 Knochen-Matrix 27
1.4.4.1 Typ I Kollagen 28
1.4.4.2 Nicht-kollagene Matrix Komponenten 30
1.4.4.3 OPG/RANK/RANKL-System 33
1.5 Ziel der Arbeit 34
2 Material und Methoden 36
2.1 Zellkultur 36
2.1.1 Isolierung von hMSC 36
2.1.2 Zellkulturbedingungen 38
2.1.3 Passagieren von Zellen 38
2.1.4 Auflauen und Einfrieren von Zellen ( hMSC) 39
2.1.5 Partikel 39
2.2 Osteogene Differenzierung hMSC 40
2.3 Zellzählung 41
2.4 Immunhistochemie 41
2.5 FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting)-Analyse/Durchfluss-
zytometrie 42
2.6 Lichtmikroskopie 44
2.7 Elektronenmikroskopie (SEM) 44
2.8 ELISA - OPG (Osteoprotegerin) 44
2.9 Kulturmedien und Lösungen 45
2.10 Statistik 45
2.11 Laborausstattung und Geräte 46
2.12 Chemikalien 47
2.13 Verbrauchsmaterialien 49
V
3 Ergebnisse 52
3.1 Start-FACS, Expression von Oberflächenmarkern auf hMSC 52
3.2 Morphologie von hMSC 55
3.3 Zellzahlmessung 58
3.3.1 Zelteahlen mittels CASY unter CoCr Partikeleinfluss 58
3.3.2 Zellzahlmessung osteogen differenzierter hMSC nach 14
Tagen 60
3.4 SEM-Bilder 63
3.4.1 Partikeleigenschaften 63
3.4.2 SEM-Morphologie unter CoCr-Partikeleinfluss 64
3.5 Immunhistochemie 71
3.5.1 Osteocalcin und Kollagen I 72
3.5.2 Osteopontin und Alkalische Phosphatase 75
3.6 ELISAOPG 77
3.7 ApoptoseFACS 78
4 Diskussion 79
4.1 Gewinnung und Bestimmung der KM-Subpopulation hMSC 81
4.2 Einfluss von CoCr Partikeln auf hMSC 82
4.2.1 Vergleich von Wachstum und Zellzahlen 82
4.2.2 Osteogene Differenzierung von hMSC unter CoCr-
Partikeleinfluss 84
4.2.3 CoCr Partikel in Auswirkung auf OPG Konzentration 87
4.2.4 Bildliche Darstellung 89
5 Zusammenfassung 94
6 Literaturverzeichnis 97
7 Danksagung 115
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Koordinatensystem der Kräfteverhältnisse am linken Femur 10
Abb. 1.2: Zoneneinteilung nach Gruen 16
Abb. 1.3: Modell der Mesengenese ausgehend von mesenchymalen
Stammzellen 19
Abb. 1.4: Modell der Differenzierungsstufen während der Osteogenese und
zugehörige Expression ausgewählter Moleküle der extrazellulären
Matrix und der Zelloberfläche 22
Abb. 1.5: Schematische Darstellung des Aufbaus von Knochengewebe 26
Abb. 1.6: Kollagen-Synthese 30
Abb. 2.1: Versuchsaufbau 37
Abb. 2.2: Prinzip der FACS-Analyse 44
Abb. 3.1: Darstellung der FACS Analyseergebnisse der hMSC
Primärkulturen 55
Abb. 3.2: Lichtmikroskopische Aufnahmen 56
Abb. 3.3: Lichtmikroskopische Aufnahmen 57
Abb. 3.4: Lichtmikroskopische Aufnahmen 58
Abb. 3.5: Lichtmikroskopische Zellzählung nach 2 Tagen Inkubation in DMEM
und Partikelkontakt 60
Abb. 3.6: Darstellung des relativen Wachstumsverhaltens nach 14 Tagen
von undifferenzierten hMSC in Kontakt zu CoCr Partikeln und
partikelfreier Kontrolle, CASY 60
Abb. 3.7: Lichtmikroskopische totale Zellzählung nach 14 Tagen Inkubation
in DMEM und CoCr Partikelkontakt 61
Abb. 3.8: Zelldichte von osteogen differenzierten hMSC in Gegenwart von
Partikeln nach 14 Tagen Inkubation-totale Zellzählung 62
Abb. 3.9: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen - Anfärbung mit Ki-67 63
Abb. 3.10: Relative Proliferationsrate bestimmt anhand von Ki-67 Färbung
nach 14 Tagen osteogener Differenzierung von hMSC 63
VII
Abb. 3.11: SEM Aufnahme CoCr Partikel ohne Zellen 64
Abb. 3.12: Darstellung der Größenverteilung von CoCr Partikeln,
Durchschnitt: 5,04 um 64
Abb. 3.13: Elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) 66
Abb. 3.14: Elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) 67
Abb. 3.15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) 68
Abb. 3.16: Elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) 69
Abb. 3.17: Elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) 70
Abb. 3.18: Durchschnittliche Größenverteilung intrazellulär gelegener CoCr
Partikel 71
Abb. 3.19: Durchschnittliche Größenverteilung extrazellulär gelegener
CoCr Partikel 71
Abb. 3.20: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen - Anfärbung mit
OCL-Kolll 73
Abb. 3.21: Intensität der Fluoreszenzanalyse von Osteocalcin 74
Abb. 3.22: Intensität der Fluoreszenzanalyse von Kollagen I 74
Abb. 3.23: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen - Anfärbung mit ALP-OPN ..76
Abb. 3.24: Intensität der Fluoreszenzanalyse von Osteopontin 77
Abb. 3.25: Intensität der Fluoreszenzanalyse von Alkalischer Phophatase 77
Abb. 3.26: Bildungsrate von OPG an Tag 3, 8, 14 unter CoCr Einfluss 78
Abb. 3.27: Relative Apoptoserate nach 48 h unter CoCr Partikeleinfluss 79
Abb. 3.28: Relative Apoptoserate nach 14 d unter CoCr Partikeleinfluss 80
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Laborausstattung und Geräte 47
Tab. 2.2: Chemikalien, Teil 1 48
Tab. 2.3: Chemikalien, Teil II 49
Tab. 2.4: Verbrauchsmaterialien 50
Tab. 3.1: Start-FACS-Analyse 54
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