Untersuchungen zum Cysteinyl-Leukotrien-2-Rezeptor-induzierten Genexpressionsmuster in Endothelzellen und Charakterisierung beteiligter Signaltransduktionswege:
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zum Cysteinyl-Leukotrien-2-Rezeptor-induzierten Genexpressionsmuster in Endothelzelle
Autor: Kramer, Cornelia
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
1 Einleitung 1
1.1 Leukotriene 1
1.1.1 Vorkommen und Biosynthese 1
1.1.2 Leukotrienrezeptoren 3
1.1.3 Biologische Wirkungen 6
1.1.3.1 Chemotaxis und Aktivierung von Entzündungszellen 6
1.1.3.2 Asthmapathogenese 6
1.1.3.3 Mitogenese 7
1.1.3.4 Leukotriene im kardiovaskulären System 8
1.1.3.5 Leukotriene und Atherosklerose 10
1.1.3.6 Leukotrienwirkungen in HUVEC 12
1.2 Klinische Bedeutung und Zielstellung 13
2 Material und Methoden 16
2.1 Material 16
2.2 Methoden 16
2.2.1 Isolierung von Endothelzellen aus der humanen Vena umbilicalis
und Kultivierung der Zellen 16
2.2.2 Nachweis funktioneller Cys-LT2-Ren mittels Messung des Anstiegs
der intrazellulären Ca2+-Konzentration 18
2.2.3 RNA-Isolierung und Quantifizierung 19
2.2.3.1 RT-PCR Analyse 20
2.2.3.2 Primerdesign und Primeretablierung 2J.
2.2.3.3 Semiquantitative PCR 22
2.2.3.4 Präparation von Standardfragmenten durch Reamplifikation 23
2.2.3.5 RT 24
2.2.3.6 Quantitative PCR (Real-Time-PCR) 25
2.2.4 Westem-Blot Analyse 26
2.2.4.1 Proteingewinnung 26
2.2.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 27
2.2.4.3 Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran 28
2.2.4.4 Immundetektion der Proteine 28
2.2.5 Angiogenese-Versuche 29
2.2.5.1 [3H]-Thymidineinbauversuch 29
2.2.5.2 Migrationsversuch 30
2.2.6 Statistische Auswertung 32
3 Ergebnisse 33
3.1 LTD4-induzierte Aufregulation Angiogenese-assoziierter Gene
in HUVEC 33
3.2 Untersuchung angiogener Effekte in HUVEC nach Aktivierung
des CysLT2-Rs durch LTD4 34
3.2.1 Etablierung des [3H]-Thymidineinbauversuches 35
3.2.2 Nachweis mitogener Effekte von LTD4 in HUVEC 35
3.2.3 Konzentrationsabhängigkeit des LTD4-induzierten mitogenen
Effektes in HUVEC 36
3.2.4 Nachweis eines mitogenen Effektes in HUVEC nach
Stimulation mit LTC4 37
3.2.5 Einfluss von Montelukast auf den LTD4- und LTC4-induzierten
mitogenen Effekt in HUVEC 38
3.2.6 Einfluss von VEGF auf die LTD4-induzierte Erhöhung des
[3H]-Thymidineinbaus in HUVEC 39
3.2.7 Untersuchung LTD4-induzierter Migration in HUVEC 40
3.3 CysLT2-R-induzierte Signalwege nach Aktivierung durch LTD4 4J.
3.3.1 Einfluss von BAPTA auf die LTD4-induzierte
Heraufregulation Angiogenese-assoziierter Gene in HUVEC 42
3.3.2 Einfluss des PKC-Inhibitors GFX109203 auf die
LTD4-induzierte Heraufregulation Angiogenese-assoziierter Gene
in HUVEC 43
3.3.3 Einfluss des Gi-Protein-Inhibitors PTX auf die
LTD4-induzierte Heraufregulation Angiogenese-assoziierter Gene
in HUVEC 44
3.3.4 Einfluss von PTX auf die LTD4-induzierte ERK1/2-Phosphorvlierung 45
3.3.5 Einfluss von GFX109203 auf die LTD4-induzierte
ERK1/2-Phosphorylierung 46
3.3.6 Einfluss von BAPTA auf die LTD4-induzierte
ERK1 /2-Phophorylierung 47
4 Diskussion 48
4.1 Aufregulation Angiogenese-assoziierter Gene 48
4.2 LTD4 induziert Proliferation in Endothelzellen 56
4.3 Signaltransduktion des CysLT2-Rs in Endothelzellen 59
4.3.1 Signalmechanismen der Genregulation 59
4.3.2 Signalmechanismen der ERK1/2- Phosphorylierung 60
4.4 Ausblick 6J.
5 Literaturverzeichnis 64
6 Anhang 9_1
6.1 Geräte, Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterial 9_1
6.1.1 Geräte 9_1
6.1.2 Chemikalien und Reagenzien 92
6.1.2.1 Chemikalien 92
6.1.2.2 Medien und Zellkulturlösungen 93
6.1.2.3 Puffer und Lösungen 93
6.1.2.4 Reagenzien 94
6.1.2.5 Kits 94
6.1.2.6 Verbrauchsmaterial 95
6.2 Abbildungsverzeichnis 96
6.3 Tabellenverzeichnis 97
Publikationen
Danksagung
Lebenslauf
Ehrenwörtliche Erklärung
Anhang
6.3 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Leukotrienbiosynthese 2
Abbildung 2: Neubauerzählkammer 18
Abbildung 3: Zellkultur-Einsätze für den Migrationsversuch 3J.
Abbildung 4: Heraufregulation Angiogenese-assoziierter Gene nach
LTD4-induzierter Aktivierung des CysLT2-Rs 34
Abbildung 5: LTD4-induzierter Anstieg des [3H]-Thymidineinbaus
in HUVEC 36
Abbildung 6: Konzentrationsabhängigkeit des LTD4-induzierten
[3H]-Thymidineinbaus in HUVEC 37
Abbildung 7: Vergleich des LTDVLTCrinduzierten
[3H]-Thymidineinbaus in HUVEC 38
Abbildung 8: LTDVLTCU-induzierter [3H]-Thymidineinbau
in HUVEC ± Montelukast 39
Abbildung 9: Einfluss von VEGF auf den LTD4-induzierten
[3H]-Thymidineinbau in HUVEC 40
Abbildung 10: LTD4-induzierte Migration in HUVEC 4_
Abbildung 11: Hemmung der LTD4-induzierten Heraufregulation
Angiogenese-assoziierter Gene in HUVEC durch BAPTA 42
Abbildung 12: Einfluss von GFX109203 auf die PMA-induzierte
Genexpressionsänderung von IL-8 in HUVEC 43
Abbildung 13: Einfluss von GFX109203 auf die LTD4-induzierte
Genexpressionsänderung in HUVEC 44
Abbildung 14: Einfluss von PTX auf die LTD4-induzierte Heraufregulation
Angiogenese-assoziierter Gene in HUVEC 45
Abbildung 15: Partielle Hemmung der LTD4-induzierten
ERK1/2-Aktivierung in HUVEC durch PTX 46
Abbildung 16: Einfluss von GFX109203 auf die LTD4-induzierte
ERK1/2-Aktivierung in HUVEC 46
Abbildung 17: Einfluss von BAPTA auf die LTD4-induzierte
ERK1/2-Aktivierung in HUVEC 47
Abbildung 18: Hypothese der CysLT-Effekte auf Endothelzellen im
Rahmen von Wundheilung 63
-96-
Anhang
6.4 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht der Leukotrienrezeptoren 4
Tabelle 2: Ca2+-Puffer (pH 7,35) 19
Tabelle 3: PCR-Primer 25
Tabelle 4: Zusammensetzung der SDS-Polyacrylamidgele 28
Tabelle 5: Hepes-Puffer (pH 7,4) 32
-97-
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