Geschlechtsdiagnose bei in vitro und in vivo gewonnenen Rinderembryonen durch Hot-Air-PCR:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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1995
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1.
EINLEITUNG
.
1
2.
LITERATURUEBERSICHT.
4
2.1.
AUSBILDUNG
DES
GESCHLECHTSDIMORPHISMUS
.
4
2.2.
HISTORISCHE
ENTWICKLUNG
DER
GESCHLECHTSDIAGNOSE
.
7
2.3.
GESCHLECHTSDIAGNOSE
AN
RINDEREMBRYONEN
.
10
2.3.1.
PRAEKONZEPTIONELLE
GESCHLECHTSBEEINFLUSSUNG
.
11
23.1.1.
CHROMOSOMENANALYSE
.
12
23.1.2.
TRENNUNG
DURCH
KOMBINATION
VON
GEGENSTROMSEDIMENTATION
UND
ELEKTRISCHEM
FELD
FCONVECTION
COUNTER
STREAMING
GALVANIZATION')
.
13
23.1.3.
FLUORESZENZMARKIERUNG
DES
Y-CHROMOSOMS
.
13
23.1.4.
GONOSOMAL
KODIERTE
GENPRODUKTE
.
14
23.1.5.
TRENNUNG
NACH
DER
MOTILITAET
.
15
23.1.6.
TRENNUNG
NACH
OBERFLAECHENLADUNG
.
16
23.1.7.
TRENNUNG
NACH
DICHTE
.
16
23.1.8.
TRENNUNG
VON
SPERMIEN
NACH
DNA-MENGE:
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
/
ZELLSORTER
.
17
23.2.
POSTKONZEPTIONELLE
GESCHLECHTSBESTIMMUNG
.
21
23.2.1.
ZYTOGENETISCHE
METHODEN
ZUR
DARSTELLUNG
DER
GESCHLECHTSCHROMOSOMEN
.
21
23.2.2.
GESCHLECHTSBESTIMMUNG
UEBER
DARSTELLUNG
DES
HY-ANTIGENS
.
24
2.3.23.
NACHWEIS
X-CHROMOSOMAL
KODIERTER
ENZYME
.
30
23.2.4.
GESCHLECHTSPEZIFISCHE
EMBRYONALE
ENTWICKLUNGS
GESCHWINDIGKEIT
.
32
23.3.
GESCHLECHTSBESTIMMUNG
BEIM
FOETUS
.
37
2.3.4.
Y-CHROMOSOM-SPEZIFISCHE
DNA-SEQUENZEN
.
38
23.4.1.
DIE
ISOLIERUNG
Y-CHROMOSOM-SPEZIFISCHER
DNA-SEQUENZEN
.
42
2.3.4.2.
GESCHLECHTSDIAGNOSE
MIT
HILFE
DER
PCR.
.
44
2.4.
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
52
2.4.1.
METHODIK
DER
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
52
2.4.2.
ABLAUF
DER
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
54
2.4.3.
PROBLEME
DER
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
56
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
65
3.1.
IN
VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
.
65
3.1.1.
MEDIENPRAEPARATION
.
65
3.I.I.I.
ZUSAETZE
.
67
3.1.2.
GEWINNUNG
DER
OVARIEN
.
68
3.1.3.
OOZYTENISOLIERUNG
UND
-BEURTEILUNG
.
68
3.1.4.
IN
VITRO-REIFUNG
.
69
3.1.5.
IN
VITRO
FERTILISIERUNG
(IVF)
.
69
3.1.6.
IN
VITRO-KULTIVIERUNG
.
70
3.1.7.
MORPHOLOGISCHE
BEURTEILUNG
DER
GEWONNENEN
EMBRYONEN
.
71
3.I.7.I.
ENTWICKLUNGSSTAND
.
71
3.1.72.
QUALITAET
.
72
32.
GEWINNUNG
VON
IN
VIVO-EMBRYONEN.
.
72
32.1.
MEDIENPRAEPARATION
.
72
3.2.2.
SUPEROVULATIONSBEHANDLUNG
UND
BESAMUNG
.
72
3.2.3.
SPUELUNG
UND
GEWINNUNG
DER
EMBRYONEN
.
73
32.4.
MORPHOLOGIE
.
73
3.3.
MIKROMANIPULATION
.
74
3.3.1.
DAS
MIKROMANIPULATIONSINSTRUMENTARIUM
.
74
3.3.2.
ENTNAHME
VON
BLASTOMEREN
(BIOPSIE)
.
74
3.4.
GESCHLECHTSDIAGNOSE
.
80
3.4.1.
METHODEN
DER
DNA-EXTRAKTION
.
80
3.4.1.1,
DIE
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
BLUT
.
80
3.4.I.2.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
EMBRYONALEN
ZELLEN
.
82
3.4.2.
POLYMERASE-CHAIN-REACTION
(PCR)
.
83
3.4.2.I.
HOT-AIR-THERMOCYDER
(ATC)
.
83
3.4.2.2.
MASSNAHMEN
GEGEN
KONTAMINATIONEN
.
84
3.4.23.
PRIMER
BZW.
OLIGONUKLEOTIDE
.
85
3.4.2.4.
TAQ-DNA-POLYMERASE-ANTIKOERPER
.
86
3.43.5.
REAKTIONSPROTOKOLL
.
86
3.4.2.6.
KONTROLLEN
.
88
3.4.3.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
88
3.5.
PRUEFUNG
DER
EMBRYONALEN
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
.
89
33.1.
KULTUR
.
89
33.1.1.
VERWENDETE
EMBRYONEN
UND
VERFAHRENSWEISE
.
89
33.1.2.
DIFFERENTIALFAERBUNG
/
DOUBLE-DYE-METHODE
.
93
3.6.
EMBRYOTRANSFER
.
94
3.6.1.
EMBRYONEN
.
94
3.6.2.
EMPFAENGERTIERE
.
95
3.6.2.I.
BRUNSTSYNCHRONISATION
.
95
3.6.2.2.
TRANSFER
.
95
3.6.23.
TRAECHTIGKEITSDIAGNOSE
MITTELS
ULTRASCHALL
.
96
3.7.
VERSUCHSAUFBAU
.
97
3.7.1.
OPTIMIERUNG
DER
PCR
ANHAND
MAENNLICHER
UND
WEIBLICHER
BLUT
PROBEN.
.
98
3.7.2.
UNTERSUCHUNGEN
AN
IN
VIVO
BZW.
IN
VITRO
EMBRYONEN
.
99
3.7.2.I.
PCR
.
99
3.7.22.
IN
VITRO-KULTUR
UND
DOUBLE-DYE-FAERBUNG
BIOPTIERTER
EMBRYONEN
.
100
3.72.3.
IN
VIVO
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
.
100
3.8.
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
100
4.
ERGEBNISSE
.
102
4.1.
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
.
102
4.1.1.
UNTERSUCHUNG
VON
DNA
AUS
RINDERBLUT
.
102
4.1.2.
PCR-PRODUKTE
.
104
42.
GESCHLECHTSBESTIMMUNG
AN
BIOPSIEPROBEN
PRAEIMPLAN
TATORISCHER
RINDEREMBRYONEN
.
105
4.2.1.
PCR
.
105
42.1.1.
ZEITDAUER
DER
GESCHLECHTSDIAGNOSE
.
105
42.1.2.
TEMPERATURKONSTANZ
.
106
4.2.2.
IN
VITRO-EMBIYONEN
.
106
42.2.1.
TEILUNGSRATE
.
106
4.22.2
VERGLEICH
DER
VERSCHIEDENEN
TESTVERFAHREN
.
107
4.22.3.
EINFLUSS
DER
EMBRYONENQUALITAET
AUF
DIE
TESTERGEBNISSE
.
107
4.2.3.
IN
VIVO-EMBRYONEN.
.
111
4.2.4.
EINFLUSS
DER
IN
VIVO-EMBRYONENQUALITAET
AUF
DAS
PCR-ERGEBNIS
.
112
4.25.
VERGLEICH
ZWISCHEN
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
EMBRYONEN
IN
DER
MIKROMANIPULATION
.
114
42.6.
PRUEFUNG
DER
EMBRYONALEN
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
.
114
42.6.1.
KULTUR
.
114
4.26.2.
DOUBLE-DYE-METHODE
.
114
42.7.
EMBRYOTRANSF
ER
.
117
42.8.
EINFLUSS
DES
ENTWICKLUNGSSTADIUMS
AUF
DAS
GESCHLECHT
.
118
5.
DISKUSSION
.
119
5.1
PCR
IM
AIR
THERMO-CYCLER
(ATC)
.
121
5.2
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
BIOPTIERTER,
IN
VITRO
ERSTELLTER
RINDER
EMBRYONEN
.
129
5.3.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
133
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
136
7.
SUMMARY
.
139
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
142
9.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
182
10.
ANHANG
.
185
10.1
MATERIALIEN
ZUR
IN
VITRO-PRODUKTION
VON
EMBRYONEN
.
185
10.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
HORMONE
.
185
10.1.2.
GERAETE
UND
KLEINMATERIAL
.
185
10.1.3.
STAMMLOESUNGEN.
.
186
10.1.4.
SPERMA
.
186
10.2
MATERIALIEN
ZUR
GEWINNUNG
VON
IN-VIVO-EMBRYONEN
.
186
10.2.1.
CHEMIKALIEN
UND
STAMMLOESUNGEN
.
186
10.2.2.
GERAETE
.
186
10.3
MATERIALIEN
ZUR
MIKROMANIPULATION
.
186
10.3.1.
CHEMIKALIEN
UND
LOESUNGEN
.
186
10.3.2.
GERAETE
UND
KLEINMATERIAL
.
187
10.4
MATERIALIEN
ZUR
GESCHLECHTSDIAGNOSE
.
187
10.4.1.
PROBENMATERIAL
.
187
10.4.2.
CHEMIKALIEN
.
187
10.4.3.
ENZYME
UND
ANTIKOERPER
.
188
10.4.4.
PRIMER
UND
DNTP'S
.
188
10.4.5.
GERAETE
UND
KLEINMATERIAL
.
188
10.4.6.
COMPUTERPROGRAMME
.
189
10.4.7.
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
.
190
10.5
MATERIALIEN
ZUR
PRUEFUNG
DER
EMBRYONALEN
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
.
191
10.5.1.
CHEMIKALIEN
.
191
10.5.2.
GERAETE
UND
KLEINMATERIAL
.
192
105.3.
STAMMLOESUNGEN
.
192
105.4.
ARBEITSLOESUNGEN
.
192
10.6
MATERIALIEN
ZUM
EMBRYOTRANSFER
.
193
10.6.1.
CHEMIKALIEN
.
193
10.6.2.
GERAETE
.
193 |
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