Das Melanomassoziierte Chondroitinsulfat-Proteoglykan (MCSP) als Zielmolekül für bispezifische Einzelketten-Antikörper:
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das maligne Melanom 1
1.1.1 Inzidenz und Risiko faktoren der Melanomentstehung 1
1.1.2 Das Melanom - eine Entartung der Melanozyten 2
1.1.3 Mutationen im Melanom 3
1.2 Therapien für das Melanom 4
1.2.1 Standardtherapien 4
1.2.2 Molekularbiologische Therapien 5
1.2.3 Immuntherapien 5
1.2 4 Antikörper-Therapien 8
1.2.4.1 Therapien mit monoklonalen Antikörpern 9
1.2.4.2 Therapien mit bispezifischen Antikörpern 10
1 3 MCSP - ein Musterkandidat für ein Zielmolekül 13
1.3.1 Expression von MCSP 13
1.3.2 Struktur des MCSP-Moleküls 14
1.3.3 Biologische Funktion 15
1.4 Zielsetzung der Arbeit 18
2 Ergebnisse 21
2.1 Epitopmapping der MCSP-Antikörper 21
2.1.1 Herstellung der MCSP/NG2-Modellmoleküle für das Epitop-mapping 21
2.1.2 Umklonieren der Konstrukte in den Expressionsvektor pEF-DHFR 27
2.1.3 Nachweis der Genexpression mittels FACS-Analyse 28
2.1 4 Untersuchung der MCSP-Antikörper auf Kreuzreaktivität mit NG2 30
2.1.5 Epitopmapping 31
2.2 Konstruktion der bispezifischen einzelkettigen Antikörper (biscAK) 34
2.3 Charakterisierung der bispezifischen Antikörper 39
2.3.1 Bestimmung der Anzahl der MCSP-Modellmoleküle auf den Transfektanten 40
2.3.2 Bestimmung der Affinität der MCSP-biscAK 45
2.3.3 Wahl eines D3-Binders 46
2.4 Zytotoxische Analysen mit MCSP-Modellmolekül-Transfektanten 48
2.4.1 Isolation von PBMCs und Stimulation von T-Zellen 48
2.4.2 Isolation stimulierter CD8-T-Zellen aus PBMC 49
2.4.3 Zytotoxische Analyse mittels Chrom-Release Assay 50
2.4.3.1 Einfluss des Abstandes von Ziel- und EfTektorzellc auf die Zclllysc 52
2.4.3.2 Einfluss der Größe des Zielmoleküls auf die Zelllyse 56
2.4.3 3 Zytotoxische Analyse mittels DI-, D2- und D3-MCSP-Bindcrn auf einer Zielzclle 59
2.4.3.4 Zeitabhängige zytotoxische Analyse 62
2.5 Konstruktion von EpCAM-MCSP-Modellmolekülcn 65
2 6 Affinitat des anti-EpCAM x ami-CD3-biscAK 69
2.7 Bestimmung der Anzahl der EpCAM- bzw. EpCAM-MCSP-Modellmolekülc auf
den Transfektanten 70
2.8 Zytotoxische Analyse mit den EpCAM- bzw. EpCAM-MCSP-Transfektanten 74
2.8 1 Einfluss des Abstandes zwischen Zielepitop und Zielzelloberfläche auf die Zelllyse 74
2.8.2 Einfluss des Epitopabstandes von der Zielzellmembran und der Größe des
Zielmoleküls auf die Zelllyse 77
3) Diskussion 81
I
Inhaltsverzeichnis
99
4) Material 99
4.1 Chemikalien jqq
4.2 Antikörper ...
4.2.1 Monoklonale Antikörper (unkonjugiert)
4.2.2 Monoklonale Antikörper (konjugiert) 101
4.2.3 Polyklonale Antikörper ...
4.2.4 Bispezifische Einzelketten-Antikörper 1Q]
4.3 Materialien für die Molekularbiologie ..
4.3.1 Puffer 101
4.3.2 Medien jq2
4.3.3 Enzyme 102
4.3.3.1 Restriktionsenzyme jq2
4.3.3.2 Enzyme für die K-lonierung j,y,
4.3.4 Reagenzien jq-j
4.3.5 Kits 103
4.3.6 Größenstandards jq-j
4.3.7 Bakterienstämme jqj
4.4 Materialien für die Zellkultur 103
4.4.1 Puffer m
4.4.2 Seren 104
4.4.3 Antibiotika 104
4.4.4 Kits I04
4.4.5 Zellen 104
4.4.5.1 Zellinien 104
4.4.5.3 Hybridomzellen jq4
4.4.5.4 Transfektanten jq5
4.4.6 Verbrauchsmaterial jq5
4.5 Materialien für die Biochemie ]05
4.5.1 Größenstandards 105
4.5.2 Polyacrylamidgel [ 05
4.5.3 Puffer 106
4.5.4 Detektion jgg
4.5.5 Verbrauchsmaterial jQg
4.6 Primer jgg
4.6.1 Primer für die Konstruktion der Modellmoleküle j07
4.6.2 Primer zur Klonierung von VL-Ketten aus murinen Hybridomzellen ^
4.6.3 Primer zur Klonierung von VH-Ketten aus murinen Hybridomzellen iQ?
4.6.4 Primer für die Synthese der biscAK jgg
4.6.5 Sequenzierprimer jqj
4.6.5.1 Primer zum Sequenzieren von D3-MCSP ^Og
4.6.5.2 Primer zum Sequenzieren des NG2-Moleküls jgg
4.6.5.3 Primer zum Sequenzieren der VL- und VH-Ketten jgg
4.6.5.4 Primer zum Sequenzieren des a-MCSP-Teils im biscAK 109
4.6.5.5 Primer zum Sequenzieren des pEF-DHFR-Vektors 109
4.7 Polylinker 109
4.8Plasmide 10o
4.9 cDNA
5) Methoden ,,q
5.1 Arbeiten mit Nukleinsäuren I j q
5.1.1 Plasmidgewinnung aus E. coli
II
Inhaltsverzeichnis
5.1.2 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 111
5.1.3 Isolation von DNA aus Agarosegelen 111
5.1.4 Restriktion von DNA 112
5.1.5 Dephosphorylierung linearer DNA-Fragmente 112
5.1.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten über Silika-Gel-Säulen 113
5.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten 113
5.1.8 Transformation in E.coli 113
5.1.9 Isolation von mRNA aus Säugerzellinien 114
5.1.10 cDNA-Synthese 114
5.1.11 Amplifikation von DNA mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 116
5.1.12 Konzentrationsbestimmung von DNA/RNA 117
5.2 Zellkultur 118
5.2.1 Allgemeine Kulturbedingungen 118
5.2.2 Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen 119
5.2.3 Transfektion von Säugerzellen in der Zellkultur 119
5.2.4 Klonieren von Zellen 120
5.3 Durchflußzytometrie 121
5.3.1 Färbung der Modellmoleküle 122
5.3.2 Direktfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern 122
5.3.3 Färbung der biscAK 123
5.4. Klonierung der VL- und VH-Ketten 123
5.4.1 Bestimmung des Isotyps von Antikörpern 123
5.4.2 Amplifikation der VL- und VH-Ketten 124
5.4.3 Anbringen von Restriktionsschnittstellen und eines Glyzin-Serin-Linkers an die
VL-und VH-Ketten 125
5.4.4 Fusions-PCR der VL- und VH-Ketten 126
5.5 Proteinbiochemie 127
5.5.1 Aufreinigung der biscAK 127
5.5.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 127
5.5.3 Coomassie-Färbung 128
5.5.4 Western Blot 128
5.6. Bestimmung der Anzahl der Zelloberflächenmoleküle 130
5.7 Zytotoxische Analyse 131
5.7.1 Isolierung und Stimulation von PBMCs aus dem Blut 131
5.7.2 Aufreinigung von CD8-T-Zel!en 132
5.7.3 Zytotoxische Analyse 133
5.8 Computerprogramme 135
6) Zusammenfassung 136
7) Literaturverweise 138
Anhang I 156
Anhang II 161
Danksagung 170
Lebenslauf 171
III
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