Konditionelle Gendeletion im Reizleitungssystem der Maus:
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2008
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| adam_text | Titel: Konditionelle Gendeletion im Reizleitungssystem der Maus
Autor: Hösl, Evelyn
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis I
I. Abkürzungsverzeichnis V
I1. Zusammenfassung VII
IM. Summary VIII
1. Einleitung 1
1.1 Das Herz 1
1.2 Der Sinusknoten 2
1.3 Die Generierung des Aktionspotentials im Sinusknoten 3
1.4HCN-Kanäle 4
1.4.1 Aufbau der HCN-Kanäle 4
1.4.2 Modulierbarkeit der HCN-Kanäle durch cAMP 5
1.4.3 Expressionsmuster der HCN-Isoformen 6
1.4.4 HCN4 - ein selektiver Marker des Sinusknotens 7
1.5 Konditionelle Gendeletion im Mausmodell - das Cre/loxP-System 8
1.5.1 Induzierbare konditionelle Knockoutmäuse 10
1.6 Ziele dieser Arbeit 11
2. Material und Methoden 12
2.1 Generierung von genetisch veränderten Mäusen 12
2.1.1 Embryonale Stammzellen 13
2.1.2 Reagenzien und Nährmedien für die Zellkultur 13
2.1.3 Embryonale Fibroblasten 14
2.1.4 Kultivierung von embryonalen Stammzellen 15
2.1.5 Homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen 16
2.1.6 Injektion genetisch modifizierter Stammzellen in Blastozysten 20
2.1.7 Testen der Chimären Mäuse auf Keimbahntransmission 20
2.2 Haltung und Zucht von Mäusen 21
2.2.1 Kontrollierte Verpaarung 21
2.2.2 Zucht von konditioneilen HCN4-Knockoutmäusen 21
2.2.3 Tamoxifen-Injektion 22
INHALTSVERZEICHNIS II
2.3 DNA-Techniken 22
2.3.1 Isolierung von Plasmid DNA 22
2.3.2 Isolierung genomischer DNA aus Zellen 23
2.3.3 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe 23
2.3.4 Phenol-Chloroform-Extraktion 23
2.3.5 DNA-Präzipitation 23
2.3.6 Restriktionsanalyse 24
2.3.7 Polymerasekettenreaktion 24
2.3.8 Agarose-Gelelektrophorese 25
2.3.9 Southernblot 25
2.4 RNA-Techniken 27
2.4.1 RNA-Isolierung 27
2.4.2 Semiquantitative RT-PCR 27
2.5 Protein-Techniken 28
2.5.1 Protein-Isolierung aus Gewebe 28
2.5.2 Protein-Konzentrationsbestimmung 29
2.5.3 Westernblot 29
2.5.4 Immunhistochemie 32
2.5.5 Immunfluoreszenz 34
2.6 Histologische Färbungen 34
2.7 X-Gal-Färbung 35
2.9 Telemetrische Elektrokardiogramm Ableitung 36
2.10 Statistik 38
3. Ergebnisse 39
3.1 Generierung der HCN4KiT-Mauslinie 39
3.1.1 Targeting-Strategie der HCN4KiT-Mauslinie 39
3.1.2 Chimären der HCN4KiT-Mauslinie und deren Keimbahnfähigkeit.... 42
3.2 DNA-Analysen der HCN4KiT-Mauslinie 43
3.2.1 Southern-Analyse der HCN4KiT-Mauslinie 43
3.2.2. Genotypisierung der HCN4KiT-Mauslinie 44
INHALTSVERZEICHNIS III
3.3 Generierung der HCN4Ki-Mauslinie 44
3.3.1 Targeting-Strategie der HCN4Ki-Mauslinie 44
3.3.2 Chimären der HCN4Ki-Mauslinie und deren Keimbahnfähigkeit 45
3.4 DNA-Analysen der HCN4Ki-Mauslinie 46
3.4.1 Southern-Analyse der HCN4Ki-Mauslinie 46
3.4.2. Genotypisierung der HCN4Ki-Mauslinie 47
3.5 Charakterisierung der HCN4KiT-Mauslinie 47
3.5.1 RNA-Analyse des Sinusknotens 48
3.5.2 Protein-Analyse des Sinusknotens 48
3.5.3 Analyse des Rekombinationsmusters mittels ACZL-Reportermaus.. 49
3.5.3.1 Rekombination in verschiedenen Geweben 50
3.5.3.2 Rekombination auf zellulärer Ebene in diversen Organen .. 52
3.5.3.3 Rekombination im Sinus- und Atrioventrikularknoten 52
3.5.3.4 Rekombination in Purkinjefasern 54
3.5.3.5 Rekombination im Gehirn bei maximaler Tamoxifen-Dosis..54
3.5.3.6 Rekombination im Maus-Embryo 55
3.5.4 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter 56
3.6 Charakterisierung konditioneller reizleitungsspezifischer
HCN4-Knockoutmäuse 58
3.6.1 RNA- und DNA-Analysen des Sinusknotens 59
3.6.2 Protein-Analyse des Sinusknotens und Thalamus 60
3.6.3 Dosis- und Zeit-Abhängigkeit der Gendeletion 62
3.6.4 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter 63
3.7 Charakterisierung der transgenen HCN4Ki-Mauslinie 67
3.7.1 Protein-Analyse des Sinusknotens 67
3.7.2 Analyse des Rekombinationsmusters in der HCN4Ki-Linie mit Hilfe
der ACZL-Reportermaus 68
3.7.2.1 Rekombination im Sinusknoten 69
3.8 Charakterisierung der nicht induzierbaren reizleitungsspezifischen
HCN4-Knockoutmäuse 70
INHALTSVERZEICHNIS IV
4. Diskussion 73
4.1 Etablierung und Charakterisierung der HCN4Ki-Mauslinie 74
4.2 Etablierung und Charakterisierung der HCN4KiT-Mausline 76
4.3 Generierung einer induzierbaren reizleitungsspezifischen
HCN4-Knockoutmaus 80
4.4 Ausblick 83
5. Anhang 85
5.1 Verwendete Oligonukleotid Primer 85
5.2 Verwendete Restriktionsenzyme 86
5.3 Verwendete Antikörper 86
5.4 Verwendete transgene Mauslinien 87
6. Literaturverzeichnis 88
6.1 Zitierte Veröffentlichungen 88
6.2 Eigene Veröffentlichungen 95
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Titel: Konditionelle Gendeletion im Reizleitungssystem der Maus
Autor: Hösl, Evelyn
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS I
Inhaltsverzeichnis I
I. Abkürzungsverzeichnis V
I1. Zusammenfassung VII
IM. Summary VIII
1. Einleitung 1
1.1 Das Herz 1
1.2 Der Sinusknoten 2
1.3 Die Generierung des Aktionspotentials im Sinusknoten 3
1.4HCN-Kanäle 4
1.4.1 Aufbau der HCN-Kanäle 4
1.4.2 Modulierbarkeit der HCN-Kanäle durch cAMP 5
1.4.3 Expressionsmuster der HCN-Isoformen 6
1.4.4 HCN4 - ein selektiver Marker des Sinusknotens 7
1.5 Konditionelle Gendeletion im Mausmodell - das Cre/loxP-System 8
1.5.1 Induzierbare konditionelle Knockoutmäuse 10
1.6 Ziele dieser Arbeit 11
2. Material und Methoden 12
2.1 Generierung von genetisch veränderten Mäusen 12
2.1.1 Embryonale Stammzellen 13
2.1.2 Reagenzien und Nährmedien für die Zellkultur 13
2.1.3 Embryonale Fibroblasten 14
2.1.4 Kultivierung von embryonalen Stammzellen 15
2.1.5 Homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen 16
2.1.6 Injektion genetisch modifizierter Stammzellen in Blastozysten 20
2.1.7 Testen der Chimären Mäuse auf Keimbahntransmission 20
2.2 Haltung und Zucht von Mäusen 21
2.2.1 Kontrollierte Verpaarung 21
2.2.2 Zucht von konditioneilen HCN4-Knockoutmäusen 21
2.2.3 Tamoxifen-Injektion 22
INHALTSVERZEICHNIS II
2.3 DNA-Techniken 22
2.3.1 Isolierung von Plasmid DNA 22
2.3.2 Isolierung genomischer DNA aus Zellen 23
2.3.3 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe 23
2.3.4 Phenol-Chloroform-Extraktion 23
2.3.5 DNA-Präzipitation 23
2.3.6 Restriktionsanalyse 24
2.3.7 Polymerasekettenreaktion 24
2.3.8 Agarose-Gelelektrophorese 25
2.3.9 Southernblot 25
2.4 RNA-Techniken 27
2.4.1 RNA-Isolierung 27
2.4.2 Semiquantitative RT-PCR 27
2.5 Protein-Techniken 28
2.5.1 Protein-Isolierung aus Gewebe 28
2.5.2 Protein-Konzentrationsbestimmung 29
2.5.3 Westernblot 29
2.5.4 Immunhistochemie 32
2.5.5 Immunfluoreszenz 34
2.6 Histologische Färbungen 34
2.7 X-Gal-Färbung 35
2.9 Telemetrische Elektrokardiogramm Ableitung 36
2.10 Statistik 38
3. Ergebnisse 39
3.1 Generierung der HCN4KiT-Mauslinie 39
3.1.1 Targeting-Strategie der HCN4KiT-Mauslinie 39
3.1.2 Chimären der HCN4KiT-Mauslinie und deren Keimbahnfähigkeit. 42
3.2 DNA-Analysen der HCN4KiT-Mauslinie 43
3.2.1 Southern-Analyse der HCN4KiT-Mauslinie 43
3.2.2. Genotypisierung der HCN4KiT-Mauslinie 44
INHALTSVERZEICHNIS III
3.3 Generierung der HCN4Ki-Mauslinie 44
3.3.1 Targeting-Strategie der HCN4Ki-Mauslinie 44
3.3.2 Chimären der HCN4Ki-Mauslinie und deren Keimbahnfähigkeit 45
3.4 DNA-Analysen der HCN4Ki-Mauslinie 46
3.4.1 Southern-Analyse der HCN4Ki-Mauslinie 46
3.4.2. Genotypisierung der HCN4Ki-Mauslinie 47
3.5 Charakterisierung der HCN4KiT-Mauslinie 47
3.5.1 RNA-Analyse des Sinusknotens 48
3.5.2 Protein-Analyse des Sinusknotens 48
3.5.3 Analyse des Rekombinationsmusters mittels ACZL-Reportermaus. 49
3.5.3.1 Rekombination in verschiedenen Geweben 50
3.5.3.2 Rekombination auf zellulärer Ebene in diversen Organen . 52
3.5.3.3 Rekombination im Sinus- und Atrioventrikularknoten 52
3.5.3.4 Rekombination in Purkinjefasern 54
3.5.3.5 Rekombination im Gehirn bei maximaler Tamoxifen-Dosis.54
3.5.3.6 Rekombination im Maus-Embryo 55
3.5.4 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter 56
3.6 Charakterisierung konditioneller reizleitungsspezifischer
HCN4-Knockoutmäuse 58
3.6.1 RNA- und DNA-Analysen des Sinusknotens 59
3.6.2 Protein-Analyse des Sinusknotens und Thalamus 60
3.6.3 Dosis- und Zeit-Abhängigkeit der Gendeletion 62
3.6.4 Analyse der Herzfrequenz und der EKG-Parameter 63
3.7 Charakterisierung der transgenen HCN4Ki-Mauslinie 67
3.7.1 Protein-Analyse des Sinusknotens 67
3.7.2 Analyse des Rekombinationsmusters in der HCN4Ki-Linie mit Hilfe
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3.7.2.1 Rekombination im Sinusknoten 69
3.8 Charakterisierung der nicht induzierbaren reizleitungsspezifischen
HCN4-Knockoutmäuse 70
INHALTSVERZEICHNIS IV
4. Diskussion 73
4.1 Etablierung und Charakterisierung der HCN4Ki-Mauslinie 74
4.2 Etablierung und Charakterisierung der HCN4KiT-Mausline 76
4.3 Generierung einer induzierbaren reizleitungsspezifischen
HCN4-Knockoutmaus 80
4.4 Ausblick 83
5. Anhang 85
5.1 Verwendete Oligonukleotid Primer 85
5.2 Verwendete Restriktionsenzyme 86
5.3 Verwendete Antikörper 86
5.4 Verwendete transgene Mauslinien 87
6. Literaturverzeichnis 88
6.1 Zitierte Veröffentlichungen 88
6.2 Eigene Veröffentlichungen 95 |
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