Intestinale kommensale Bakterien als potentielle Inhibitoren oder Aktivatoren einer CD4_1hn+-T-Zell-induzierten Kolitis in Rag1_1hn-_1hn/_1hn--Mäusen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis _
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen lv
1. Einleitung 1
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) 1
1.1.1 Inzidenz und Prävalenz der CED 2
1.1.2 Therapiemöglichkeiten der CED 3
1.2 Tiermodelle 3
1.2.1 Adoptives T-Zell-Transfermodell 5
1.3 Die intestinale Mikroflora 5
1.3.1 Bacteroides vulgatus mpk 7
1.3.2 Escherichia coli mpk 8
1.3.3 Escherichia co//Nissle 1917 8
1.4 Genexpressionsanalysen von Bakterien in vivo mittels differenzieller Fluoreszenzinduktion
(DFI) 10
1.5 Das mukosale Immunsystem 12
1.5.1 Aufbau des darmassoziierten lymphatischen Gewebes - 12
1.5.2 Die Epithelbamere 13
1.5.3 Angeborene Immunität 1*
1.5.4 Adaptive Immunität 17
1.5.5 Dendritische Zellen (DZ) 17
1.5.6 T-Lymphozyten 19
1.5.6.1 Regulatorische T-Lymphozyten 22
1.6 Wissenschaftliche Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 25
2 Material und Methoden 26,«»,.
2.1 Material 26
2.1.1 Mäuse 26
2.1.2 Bakterienstämme und Plasmide 27
2.1.3 PCR-Primer 27
2.1.4 Primer für die quantitative real Urne PCR (qRT-PCR) 28
2.1.3 Antikörper für die Durchflusszytometrie 29
2.1.6 Software 29
2.2 Methoden 30
2.2.1 Bakterienkultur und orale Infektion 30
2.2.2 Kryokonservierung von Bakterien 31
2.2.3 Bakteriensort 31
2.2.4 CFU-Bestimmung aus Fäces 31
2.2.5 Einzelkotonie-PCR (cotony PCR) 31
2.2.6 Gelelektrophorese 32
2.2.7 PlasmidisolaUon 33
i
Inhaltsverzeichnis
2.2.8 Sequenzierung 33
2.2.9 Isolation von primären Zellen 33
2.2.10 Isolation und adoptiver Transfer der CD4*T-Zellen 34
2.2.11 Durchflusszytometrische Analyse 35
2.2.12 Histologie 36
2.2.13 Kryofixierung von Kolongewebe 36
2.2.14 RNA Isolation 36
2.2.15 RNA-Quantifizierung 37
2.2.16 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 37
2.2.17 Quantifizierung spezifischer mRNA mittels quantitativer RT-PCR 38
2.2.18 Statistik 40
3 Ergebnisse 41
3.1 Einftuss der intestinalen Flora auf die Entstehung einer CD4* T-Zell-abhängigen Kolitis in
Rag»-* Mäusen 41
3.1.1 Gnotobiotische Rag1 ~ und spezifisch pathogen freie (SPF) Rag1J Mäuse entwickeln keine
Kolitis 41
3.1.2 Charakterisierung dendritischer Zellen in der Lamina Propria des Kolons 43
3.1.3 Die Repopulation der donor T-Zellen in Ragi* Mäusen ist abhängig vom Phänotyp der
dendritischen Zellen in der Lamina Propria 46
3.1.4 Induktion von regulatorischen T-Zellen (T,.,) in E. coli mpk monokolonisierten Rag1* und SPF
Rag1* Mäusen 47
3.1.5 Die Kolitisinduktion ist nur in CV Rag1J Mäusen möglich, deren Flora mehr Pmteobacteria
aufweist als Bacteroidetes 50
3.1.6 Änderung der residenten Flora verhindert bzw. induziert eine Kolitis 50
3.2 Analyse der Genexpression von E. coli mpk in vivo im Caecum unterschiedlich kolonisierter
Mäuse mittels differentieller Fluoreszenzinduktion (DFI) 57
3.2.1 Induktion unter SPF Bedingungen 57
3.2.2 Induktion unter keimfreien Bedingungen 60
3.2.3 Induktion unter S. vulgalus mpk monokolonisierten Bedingungen 63
3.2.4 Reinduktion von fadIJ unter keimfreien, SPF und B. vulgatus mpk monokolonisierten
Bedingungen 66
3.3 Protektive Effekte von E. coli Nissle 1917 in Rag** Mäusen mit einer konventionellen Flora
(CV) 68
3.3.1 Kolonisierung von CV Rag1J Mäusen mit E. coli Nissle schützt vor einer T-Zell-induzierten
Kolitis 68
3.3.2 Kolonisierung mit Flagellenmutante attenuiert den E. coli Nissle vermittelten Schutz vor Kolitis
nach T-Zell-Transfer 71
4 Diskussion 73
4.1 Einfluss unterschiedlicher kommensaler Bakterien auf die Repopulation von donor CD4* T-
Zellen in Rag7v Mausen 73
»
Inhaltsvmzeichnis
4.1.1 Die Art der Flora ist entscheidend für eine Kolitisinduktion im adoptiven T-Zell-Transfer-Modell
73
4.1.2 B. vulgatus mpk induziert in monokolonisierten Rag1J Mäusen semimature DZ, die keine T-
Zell-Aktivierung bewirken 75
4.1.3 Induktion von CD103* (otßj) regulatorischen T-Zellen (T„g) in E. coli mpk monokolonisierten
Rag1+ und SPF Ragi* Mäusen 78
4.1.4 Durch Änderung der SPF und CV Flora lässt sich eine Kolitis induzieren bzw. verhindern.... 80
4.2 Analyse der Genexpression von E. coli mpk in vivo im Caecum unterschiedlich kolonisierter
Mäuse mittels differentieller Fluoreszenzinduktion (DFI) 82
4.3 Protektive Effekte von E. coli Nissle 1917 in CV Rag1 Mäusen 86
4.3.1 Der E. coli Nissle vermittelte Schutz vor einer T-ZeIMnduzierten Kolitis in CV Ragi* Mausen
scheint flagellenabhängig zu sein 86
5 Zusammenfassung 88
6 Anhang X
Literaturverzeichnis X
eigene Arbeiten XXVII
Gensequenzen XLII
Lebenslauf XLVIII
in
|
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Inhaltsverzeichnis _
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis '
Abkürzungen lv
1. Einleitung 1
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) 1
1.1.1 Inzidenz und Prävalenz der CED 2
1.1.2 Therapiemöglichkeiten der CED 3
1.2 Tiermodelle 3
1.2.1 Adoptives T-Zell-Transfermodell 5
1.3 Die intestinale Mikroflora 5
1.3.1 Bacteroides vulgatus mpk 7
1.3.2 Escherichia coli mpk 8
1.3.3 Escherichia co//Nissle 1917 8
1.4 Genexpressionsanalysen von Bakterien in vivo mittels differenzieller Fluoreszenzinduktion
(DFI) 10
1.5 Das mukosale Immunsystem 12
1.5.1 Aufbau des darmassoziierten lymphatischen Gewebes - 12
1.5.2 Die Epithelbamere 13
1.5.3 Angeborene Immunität 1*
1.5.4 Adaptive Immunität 17
1.5.5 Dendritische Zellen (DZ) 17
1.5.6 T-Lymphozyten 19
1.5.6.1 Regulatorische T-Lymphozyten 22
1.6 Wissenschaftliche Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 25
2 Material und Methoden 26,«»,.
2.1 Material 26
2.1.1 Mäuse 26
2.1.2 Bakterienstämme und Plasmide 27
2.1.3 PCR-Primer 27
2.1.4 Primer für die quantitative real Urne PCR (qRT-PCR) 28
2.1.3 Antikörper für die Durchflusszytometrie 29
2.1.6 Software 29
2.2 Methoden 30
2.2.1 Bakterienkultur und orale Infektion 30
2.2.2 Kryokonservierung von Bakterien 31
2.2.3 Bakteriensort 31
2.2.4 CFU-Bestimmung aus Fäces 31
2.2.5 Einzelkotonie-PCR (cotony PCR) 31
2.2.6 Gelelektrophorese 32
2.2.7 PlasmidisolaUon 33
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Inhaltsverzeichnis
2.2.8 Sequenzierung 33
2.2.9 Isolation von primären Zellen 33
2.2.10 Isolation und adoptiver Transfer der CD4*T-Zellen 34
2.2.11 Durchflusszytometrische Analyse 35
2.2.12 Histologie 36
2.2.13 Kryofixierung von Kolongewebe 36
2.2.14 RNA Isolation 36
2.2.15 RNA-Quantifizierung 37
2.2.16 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 37
2.2.17 Quantifizierung spezifischer mRNA mittels quantitativer RT-PCR 38
2.2.18 Statistik 40
3 Ergebnisse 41
3.1 Einftuss der intestinalen Flora auf die Entstehung einer CD4* T-Zell-abhängigen Kolitis in
Rag»-* Mäusen 41
3.1.1 Gnotobiotische Rag1''~ und spezifisch pathogen freie (SPF) Rag1J" Mäuse entwickeln keine
Kolitis 41
3.1.2 Charakterisierung dendritischer Zellen in der Lamina Propria des Kolons 43
3.1.3 Die Repopulation der donor T-Zellen in Ragi* Mäusen ist abhängig vom Phänotyp der
dendritischen Zellen in der Lamina Propria 46
3.1.4 Induktion von regulatorischen T-Zellen (T,.,) in E. coli mpk monokolonisierten Rag1* und SPF
Rag1* Mäusen 47
3.1.5 Die Kolitisinduktion ist nur in CV Rag1J Mäusen möglich, deren Flora mehr Pmteobacteria
aufweist als Bacteroidetes 50
3.1.6 Änderung der residenten Flora verhindert bzw. induziert eine Kolitis 50
3.2 Analyse der Genexpression von E. coli mpk in vivo im Caecum unterschiedlich kolonisierter
Mäuse mittels differentieller Fluoreszenzinduktion (DFI) 57
3.2.1 Induktion unter SPF Bedingungen 57
3.2.2 Induktion unter keimfreien Bedingungen 60
3.2.3 Induktion unter S. vulgalus mpk monokolonisierten Bedingungen 63
3.2.4 Reinduktion von fadIJ unter keimfreien, SPF und B. vulgatus mpk monokolonisierten
Bedingungen 66
3.3 Protektive Effekte von E. coli Nissle 1917 in Rag** Mäusen mit einer konventionellen Flora
(CV) 68
3.3.1 Kolonisierung von CV Rag1J' Mäusen mit E. coli Nissle schützt vor einer T-Zell-induzierten
Kolitis 68
3.3.2 Kolonisierung mit Flagellenmutante attenuiert den E. coli Nissle vermittelten Schutz vor Kolitis
nach T-Zell-Transfer 71
4 Diskussion 73
4.1 Einfluss unterschiedlicher kommensaler Bakterien auf die Repopulation von donor CD4* T-
Zellen in Rag7v Mausen 73
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Inhaltsvmzeichnis
4.1.1 Die Art der Flora ist entscheidend für eine Kolitisinduktion im adoptiven T-Zell-Transfer-Modell
73
4.1.2 B. vulgatus mpk induziert in monokolonisierten Rag1J" Mäusen semimature DZ, die keine T-
Zell-Aktivierung bewirken 75
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Rag1+ und SPF Ragi* Mäusen 78
4.1.4 Durch Änderung der SPF und CV Flora lässt sich eine Kolitis induzieren bzw. verhindern. 80
4.2 Analyse der Genexpression von E. coli mpk in vivo im Caecum unterschiedlich kolonisierter
Mäuse mittels differentieller Fluoreszenzinduktion (DFI) 82
4.3 Protektive Effekte von E. coli Nissle 1917 in CV Rag1''' Mäusen 86
4.3.1 Der E. coli Nissle vermittelte Schutz vor einer T-ZeIMnduzierten Kolitis in CV Ragi* Mausen
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