Untersuchungen an PC-12-Zellen auf Multi-Elektroden-Arrays (MEA):
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
2008
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| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | [6], 103 S. Ill., graph. Darst. |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 PC 12-Zellen - eine svmpathoadrenale Zelllinie 1
1.1.1 Die Ursprunasqewebe - Nebennierenmark und Phäochromozvtom 1
1.1.2 DiePC12-Zelllinie 1
1.1.3 Der Nervenwachstumsfaktor als neurotropher Faktor für PC 12-Zellen 2
1.1.4 Eigenschaften der PC 12-Zellen unter Differenzierung mit NGF 3
1.2 MEA-Svsteme: Ursprung und Aufbau 6
1.2.1 Einführung 6
1.2.2 Messmethoden: Patch-Clamp und MEA 6
1.2.3 Aufbau von MEA-Svstemen 7
1.2.4 Messung intrazellulärer Signale und extrazellulärer Feldpotentiale 8
1.2.5 Zelllinien mit nachgewiesener Aktivität auf MEA 10
1.3 Ziele der vorliegenden Arbeit 11
2. MATERIAL UND METHODEN 12
2.1. Material 12
2.1.1 Geräte 12
2.1.2 Verbrauchsmittel 13
2.1.3 Chemikalien und Medien 15
Chemikalien und Medien zur Zellkultur 15
Chemikalien und Medien zur MEA-Messung 16
2.2 Methoden 17
2.2.1 Kultivierung der Zellen 17
Herstellung des Kulturmediums 17
Zellkultur 17
Inhaltsverzeichnis
2.2.2 Vorbereitung der Multi-Elektroden-Felder 18
Desinfektion 18
Beschichtunq 18
Nitrocellulose 18
Polylysin 18
Zelleinsaat 19
Kulturwachstum und Differenzierung 19
2.2.3 Aufbau des Multi-Elektroden-Arrav 60 System 20
2.2.4 Messungen mit dem MEA-60-System 23
Vorbereitungen 23
MEA-Messungen mit Testlösungen in RPMI-Medium 23
MEA-Messungen mit Testlösungen in Standardmesslösung (SBS) 23
MEA-Messungen ohne PC 12-Zellen (Kontrolle) 24
Aufnahme der Rohdaten 24
MEA-Säuberung 26
2.2.5 Auswertung und Analyse der Daten 27
Fotografische Auswertung von PC 12-Zellen auf MEA-Elektroden 27
Datenverarbeitung und -analyse 27
3. ERGEBNISSE 30
3.1 Wachstum und Eigenschaften der PC 12-Zellen auf dem MEA 30
3.1.1 Kultivierung der PC 12-Zellen 30
PC 12-Zellkultur in Kulturflaschen 30
PC12-ZellkulturaufMEA 31
Übersicht zu MEA-Experimenten mit PC 12-Zellkulturen 32
3.1.2 Beschickung der MEA für PC 12-Zellen 33
3.1.3 Differenzierung der PC 12-Zellen 37
Differenzierung der PC 12-Zellen in Kulturschalen 37
Einfluss der Zelldichte auf die Differenzierung durch NGF 39
Einfluss der NGF-Konzentration auf die Differenzierung 39
Einfluss der NGF-freien Kultivierungszeit auf die Differenzierung 42
Einfluss der Serumkonzentration auf das Wachstum der PC 12-Zellen 43
Differenzierung der PC 12-Zellen auf MEA 49
Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Verhalten der PC 12-Zellen in Extrazellulärlösung (SBS) 54
3.1.5 Kulturvoraussetzunqen für PC 12-Zellen auf MEA 55
3.2 MEA-Messunaen mit PC 12-Zellen 56
3.2.1 Rohdaten der PC 12-Zellen 57
3.2.2 Datenanalvse - Prüfung der Rohdaten auf Spontanaktivität 57
Signale mit eindeutiger Siqnal-to-Noise-Ratio 57
Einfluss von Mediumwechsel. Glutamat und KCI auf die gefundenen Signale 64
Einfluss der Dauer der Differenzierung auf die gefundenen Signale 64
Signale mit einem Schwellenpotential nahe am Grundrauschen der Rohdaten 67
Signale mit einer bestimmten Wellenform im Grundrauschen der Rohdaten 67
Signale in der Kontrollgruppe 67
3.2.3 Störungen 69
4. DISKUSSION 70
4.1 Kulturbedingunqen der PC 12-Zellen auf MEA 70
4.1.1 Polvlysin als Beschichtung für PC 12-Zellen auf MEA 70
4.1.2 Einsaat von PC 12-Zellen auf MEA und ihre Folgen für die Differenzierung 71
4.1.3 Weitere Faktoren mit Einfluss auf die Differenzierung der PC 12-Zellen 72
4.2 Haftung der PC 12-Zellen auf Kulturoberflächen wie MEA 74
4.2.1 Aggregatbildung der PC 12-Zellen 74
4.2.2 Beschichtunqen für PC 12-Zellen auf Kulturoberflächen 75
4.2.3 Möglichkeiten der Verbesserung der Haftung von PC 12-Zellen auf MEA 76
4.3 Signale bei Ableitungen von PC 12-Zellen auf MEA 77
4.3.1 Interpretation der Signale bei Ableitungen von PC 12-Zellen auf MEA 77
4.3.2 Nachteile offener MEA-Svsteme - Einfluss von pH und Osmolarität 78
4.3.3 Spontanaktivität und Stimulation auf MEA 79
4.3.4 Artefakte durch Bildung von Gasblasen und defekte Elektroden 80
4.3.5. Ausschließlichkeit der Signale 82
4.3.5 Schlussfolgerung 82
Inhaltsverzeichnis
5. ZUSAMMENFASSUNG 83
6. LITERATUR 86
7. ANHANG 98
7.1 Verzeichnis der Abbildungen 98
7.2 Verzeichnis der Tabellen und Übersichten 101
7.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 102
7,4, Zum Autor 103
7. ANHANG
7.1 Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1: Standard-MEA Seite 7
Abb. 2: TiN-Elektroden und ihre Leitungen in die Peripherie im 8 * 8 Elektrodenfeld eines Standard-MEA. Seite 7
Rechts: TiN-Elektrode und ein Ausschnitt ihrer Mikrostruktur
Abb. 3: Vergleich einer intrazellulären Spannung und ihrer korrespondierenden extrazellulären Spannung: Seite 8
Gauss-ähnliches Membranpotential einer Voltage-Clamp-Messung und MEA-Aufnahme der
korrespondierenden extrazellulären Spannung sowie erste Ableitung des Membranpotentials, (aus Stett et
al. 2003)
Abb. 4: Differenzierung eines intrazellulären Signals über der Zeit: Erste bis dritte Ableitung des Signals Seite 9
über der Zeit (aus Connolly et al. 1990)
Abb. 5: Fortleitung eines Aktionspotentials entlang eines Axons (Johnston und Wu 1995) Seite 9
Abb. 6: Ein gemessenes Signal als Abbild des Urprungssignals der Zellen bzw. Zellschichten. Seite 10
Beeinflussung des Signals durch verschiedene Parameter der Signalkaskade, (nach Stett et al. 2003)
Abb. 7: Planares Multi-Elektroden-Feld mit steriler Verschlusskappe Seite 20
Abb. 8: MEA-60-System (Schema) Seite 21
Abb. 9: MEA-60-Verstärker mit eingesetztem Multi-Elektroden-Feld vor der Montage Seite 22
Abb. 10: MEA-60-Verstärker mit eingesetztem Multi-Elektroden-Feld und Aluminium-Abdeckung nach der Seite 22
Montage
Abb. 11: MEA-60-Verstärker mit MEA Aluminiumabdeckung und Temperaturkontrolleinheit Seite 22
Abb. 12: Aufbau des „Recorder Rack (MC Rack Software) Seite 24
Abb. 13: Aufbau des „Replayer/Analyzer Rack (MC Rack Software) Seite 27
Abb. 14: Datenauswertung mit dem „Replayer Rack (MC Rack Software) Seite 28
Fig. 1: PC 12-Zellkultur in kleiner Kulturfiasche Seite 30
Fig. 2: PC 12-Zellen auf MEA nach 2 Tagen Kultivierung ohne NGF Seite 31
Fig. 3: PC 12-Zellen nach Splitt ohne Trypsin-EDTA Seite 31
Fig. 4: PC 12-Zellen nach Splitt mit Trypsin-EDTA Seite 31
Fig. 5: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Nitrocellulose-Membran Seite 33
Fig. 6: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Poly-D-Lysin Seite 33
Fig. 7: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Nitrocellulose. Erste Kultur auf vorher unbenutztem MEA Seite 34
Fig. 8: MEA in der darauf folgenden Passage, ohne PC 12-Zellen - Überlappung alter und neuer Seite 34
BeSchichtung
Fig. 9: PC 12-Zellen auf Poly-D-Lysin vor dem Mediumwechsel Seite 35
Fig. 10: PC 12-Zellen auf Poly-D-Lysin nach vollständigem Mediumwechsel Seite 35
Fig. 11: Kultur von PC 12-Zellen auf einem neuen MEA Seite 35
99 Anhang
Fig. 12: PC 12-Zellen in großer Kulturflasche nach 3 Tagen Kultivierung ohne NGF und anschließender Seite 37
Differenzierung über 2 Tage mit 100 ng/ ml NGF
Fig. 13: PC 12-Zellen der 1. Zellkultur am 2. Tag der Differenzierung mit 100ng/ml NGF Seite 37
(Ausschnitt aus Fig. 12)
Fig. 14: PC 12-Zellen der 1. Zellkultur am 4. Tag der Differenzierung mit 100 ng/ ml NGF Seite 37
Fig. 15: PC 12-Zellen der 2. Zellkultur am 3. Tag der Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 38
Fig. 16: PC 12-Zellen der 2. Zellkultur am 8. Tag der Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 38
Fig. 17: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Kultur ohne Differenzierung mit NGF Seite 40
Fig. 18: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Differenzierung mit 50 ng/ml NGF Seite 40
Fig. 19: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml Seite 40
Fig. 20: PC 12-Zellen in Multiwellschalen nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF über 9 Tage Seite 41
Fig. 21: PC 12-Zellen in Multiwellschalen nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF über 9 Tage Seite 41
Fig. 22: Zellaggregation und -ablösung. Mitte einer PC 12-Kultur nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 41
über 8 Tage
Fig. 23: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Kultivierung ohne NGF A: in 15% Serum. B: in Seite 44
1 % Serum
Fig. 24: Rand einer PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Kultivierung ohne NGF) A: in 15% Serum. B: in 1 % Seite 44
Serum
Fig. 25: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Kultivierung ohne NGF A: in 15% Serum. B: in 1 % Seite 45
Serum
Fig. 26: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Kultur in 1 % Serum Seite 45
mit NGF
Fig. 27: Rand einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF. A: in 15 % Serum. Seite 46
B: in 1 % Serum
Fig. 28: PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF A: in 15 % Serum. B: in 1 % Seite 46
Serum. Ausdifferenzierte Zellformationen in beiden Serumkonzentrationen
Fig. 29: PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF. Ausgeprägtere Differenzierung Seite 47
bei Zellen, die mit 15% Serum im Medium kultiviert wurden. A: in 15 % Serum. B: in 1 % Serum.
Hochdifferenzierte PC 12-Zellen C: in 15 % Serum. D: in 1 % Serum
Fig. 30: PC 12-Zellaggregat mit bläschenförmigen Zellsomata. PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Seite 48
Differenzierung mit 200 ng/ml NGF und 1 % Serumkonzentration
Fig. 31: PC 12-Zellen auf MEA nach Differenzierung über 52 Stunden mit NGF 50 ng/ml Seite 49
Fig. 32: PC 12-Zellen auf MEA nach Differenzierung mit NGF über 5 Tage Seite 50
Fig. 33: PC 12-Zellen auf MEA: nach Differenzierung mit NGF. A: 2 Tage. B: 4 Tage. C: 7 Tage. Seite 51
Fig. 34: PC 12-Zellen nach Differenzierung mit NGF in A: 52 h. in B: 5 Tage Seite 52
Fig. 35 A: PC 12-Zellkultur auf MEA 3200 PC 12-Zellen/cm2 nach 4 h Wachstum in NGF-freiem Medium Seite 54
und anschließender Differenzierung mit 100 ng/ml NGF über 8 Tage. Mit Gentamicin. 10x Vergrößerung.
B: Kurz nach Entfernen des Kultumediums und Zugabe von 1 ml magnesiumfreier Extrazellulärlösung. Im
gezeigten Ausschnitt hatte sich die PC 12-Zellkultur fast vollständig abgelöst
Fig. 36: Gesamtzahl der Messungen von PC 12-Zellen auf MEA nach Anzahl der Tage unter Seite 56
Differenzierung mit NGF
Fig. 37: Rohdaten eines MEA bewachsen mit PC 12-Zellen, 10 Tage nach Differenzierung mit NGF. Seite 57
Messung in RPMI. Dargestellt ist die 3. Sekunde nach Installation des MEA im Verstärker
Anhang 100
Fig. 38: Signal einer bewachsenen MEA-Elektrode, dass sich eindeutig vom Grundrauschen abhebt Seite 60
Fig. 39: Signal auf unbewachsener MEA-Elektrode, das sich eindeutig vom Grundrauschen abhebt Seite 60
Fig. 40: Signale auf einzelnen Elektroden Seite 62
Fig. 41 :Einzelsignale Seite 63
Fig. 42: Signale in Gruppen Seite 63
Fig. 43: Anzahl der gefundenen Signale bei einem Schwellenpotential von + 5* S.D. nach der Zeit der Seite 65
Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Fig. 44: Anzahl der gefundenen Signale bei einem Schwellenpotential von - 5* S.D. nach der Zeit der Seite 66
Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Fig. 45: Signale auf MEA ohne PC 12-Zellen und mit 1ml RPMI-Standardmedium während der Messung Seite 68
Fig. 46: Störung der Rohdaten eines MEA. Sinuswellen im Frequenzbereich des Stromnetzes Seite 69
Fig. 47 MEA mit Signalen, die sich eindeutig aus dem Grundrauschen abheben. Zusätzlich überlagerte Seite 69
Störung im Sinuswellenbereich
101 Anhang
7.2 Verzeichnis der Tabellen und Übersichten
Tab. 1: Geräte Seite 12
Tab. 2: Verbrauchsmittel Seite 13
Tab. 3: Medien zur Zellkultivierung Seite 15
Tab. 4: Bestandteile und technische Daten des MEA 60 Systems Seite 20
Tab. 5: Verwendete Messschemata 1 und 2 bei Messungen mit MEA Seite 25
Tab. 6: Gesamtzahl der durchgeführten PC 12-Kulturen auf MEA Seite 32
Tab. 7: Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses der Zellzahl und der NGF-Konzentration auf die Seite 39
Differenzierung
Tab. 8 Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses der NGF-Konzentration auf die Differenzierung bei Seite 39
konstanter Zellzahl
Tab. 9: Versuchsaufbau zur Optimierung der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF Seite 42
Tab. 10: Versuchsaufbau zum Einfluss der Serumkonzentration auf die Differenzierung der PC 12-Zellen mit Seite 43
NGF
Tab. 11: Aufstellung aller gefundenen Signale mit eindeutiger Signal-to-Noise-Ratio in Abhängigkeit von den Seite 58
Einzelmessungen mit unterschiedlicher Behandlung der Kulturen bei positivem Schwellenpotential
Tab. 12: Aufstellung aller gefundenen Signale mit eindeutiger Signal-to-Noise-Ratio in Abhängigkeit von den Seite 59
Einzelmessungen mit unterschiedlicher Behandlung der Kulturen bei negativem Schwellenpotential
Tab. 13: Aufschlüsselung der gefundenen Einzelsignale bei einem Schwellenpotential von + 5* S.D. nach der Seite 65
Zeit der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Tab. 14: Aufschlüsselung der gefundenen Einzelsignale bei einem Schwellenpotential von - 5* S.D. nach der Seite 66
Zeit der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Tab. 15: Auflistung aller eindeutig identifizierten Signale auf bewachsenen und unbewachsenen MEA. Für die Seite 67
rechte Spalte wurden die Angaben aus Tab. 11 und 12 verwendet. Die unterschiedlichen Gesamtzahlen
kommen dadurch zustande, dass gleiche Signale mit -5facher S.D. und +5facher S.D. gefunden werden
konnten, diese aber nur einfach in die Gesamtrechnung eingingen
Tab. 16: Oberflächenbeschichtungen zur Anheftung von PC 12-Zellen Sejte 75
Übersicht 1: Faktoren zur Beschichtung von MEA für eine Kultur mit PC 12-Zellen Seite 36
Übersicht 2: Bedingungen für die Differenzierung von PC 12-Zellen mit NGF auf MEA Seite 52
Übersicht 3: Faktoren mit Einfluss auf die Aggregatbildung der PC 12-Zellen auf MEA Seite 53
Übersicht 4: Voraussetzungen für Kultivierung und Differenzierung von PC 12-Zellen auf MEA Seite 55
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| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 PC 12-Zellen - eine svmpathoadrenale Zelllinie 1
1.1.1 Die Ursprunasqewebe - Nebennierenmark und Phäochromozvtom 1
1.1.2 DiePC12-Zelllinie 1
1.1.3 Der Nervenwachstumsfaktor als neurotropher Faktor für PC 12-Zellen 2
1.1.4 Eigenschaften der PC 12-Zellen unter Differenzierung mit NGF 3
1.2 MEA-Svsteme: Ursprung und Aufbau 6
1.2.1 Einführung 6
1.2.2 Messmethoden: Patch-Clamp und MEA 6
1.2.3 Aufbau von MEA-Svstemen 7
1.2.4 Messung intrazellulärer Signale und extrazellulärer Feldpotentiale 8
1.2.5 Zelllinien mit nachgewiesener Aktivität auf MEA 10
1.3 Ziele der vorliegenden Arbeit 11
2. MATERIAL UND METHODEN 12
2.1. Material 12
2.1.1 Geräte 12
2.1.2 Verbrauchsmittel 13
2.1.3 Chemikalien und Medien 15
Chemikalien und Medien zur Zellkultur 15
Chemikalien und Medien zur MEA-Messung 16
2.2 Methoden 17
2.2.1 Kultivierung der Zellen 17
Herstellung des Kulturmediums 17
Zellkultur 17
Inhaltsverzeichnis
2.2.2 Vorbereitung der Multi-Elektroden-Felder 18
Desinfektion 18
Beschichtunq 18
Nitrocellulose 18
Polylysin 18
Zelleinsaat 19
Kulturwachstum und Differenzierung 19
2.2.3 Aufbau des Multi-Elektroden-Arrav 60 System 20
2.2.4 Messungen mit dem MEA-60-System 23
Vorbereitungen 23
MEA-Messungen mit Testlösungen in RPMI-Medium 23
MEA-Messungen mit Testlösungen in Standardmesslösung (SBS) 23
MEA-Messungen ohne PC 12-Zellen (Kontrolle) 24
Aufnahme der Rohdaten 24
MEA-Säuberung 26
2.2.5 Auswertung und Analyse der Daten 27
Fotografische Auswertung von PC 12-Zellen auf MEA-Elektroden 27
Datenverarbeitung und -analyse 27
3. ERGEBNISSE 30
3.1 Wachstum und Eigenschaften der PC 12-Zellen auf dem MEA 30
3.1.1 Kultivierung der PC 12-Zellen 30
PC 12-Zellkultur in Kulturflaschen 30
PC12-ZellkulturaufMEA 31
Übersicht zu MEA-Experimenten mit PC 12-Zellkulturen 32
3.1.2 Beschickung der MEA für PC 12-Zellen 33
3.1.3 Differenzierung der PC 12-Zellen 37
Differenzierung der PC 12-Zellen in Kulturschalen 37
Einfluss der Zelldichte auf die Differenzierung durch NGF 39
Einfluss der NGF-Konzentration auf die Differenzierung 39
Einfluss der NGF-freien Kultivierungszeit auf die Differenzierung 42
Einfluss der Serumkonzentration auf das Wachstum der PC 12-Zellen 43
Differenzierung der PC 12-Zellen auf MEA 49
Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Verhalten der PC 12-Zellen in Extrazellulärlösung (SBS) 54
3.1.5 Kulturvoraussetzunqen für PC 12-Zellen auf MEA 55
3.2 MEA-Messunaen mit PC 12-Zellen 56
3.2.1 Rohdaten der PC 12-Zellen 57
3.2.2 Datenanalvse - Prüfung der Rohdaten auf Spontanaktivität 57
Signale mit eindeutiger Siqnal-to-Noise-Ratio 57
Einfluss von Mediumwechsel. Glutamat und KCI auf die gefundenen Signale 64
Einfluss der Dauer der Differenzierung auf die gefundenen Signale 64
Signale mit einem Schwellenpotential nahe am Grundrauschen der Rohdaten 67
Signale mit einer bestimmten Wellenform im Grundrauschen der Rohdaten 67
Signale in der Kontrollgruppe 67
3.2.3 Störungen 69
4. DISKUSSION 70
4.1 Kulturbedingunqen der PC 12-Zellen auf MEA 70
4.1.1 Polvlysin als Beschichtung für PC 12-Zellen auf MEA 70
4.1.2 Einsaat von PC 12-Zellen auf MEA und ihre Folgen für die Differenzierung 71
4.1.3 Weitere Faktoren mit Einfluss auf die Differenzierung der PC 12-Zellen 72
4.2 Haftung der PC 12-Zellen auf Kulturoberflächen wie MEA 74
4.2.1 Aggregatbildung der PC 12-Zellen 74
4.2.2 Beschichtunqen für PC 12-Zellen auf Kulturoberflächen 75
4.2.3 Möglichkeiten der Verbesserung der Haftung von PC 12-Zellen auf MEA 76
4.3 Signale bei Ableitungen von PC 12-Zellen auf MEA 77
4.3.1 Interpretation der Signale bei Ableitungen von PC 12-Zellen auf MEA 77
4.3.2 Nachteile offener MEA-Svsteme - Einfluss von pH und Osmolarität 78
4.3.3 Spontanaktivität und Stimulation auf MEA 79
4.3.4 Artefakte durch Bildung von Gasblasen und defekte Elektroden 80
4.3.5. Ausschließlichkeit der Signale 82
4.3.5 Schlussfolgerung 82
Inhaltsverzeichnis
5. ZUSAMMENFASSUNG 83
6. LITERATUR 86
7. ANHANG 98
7.1 Verzeichnis der Abbildungen 98
7.2 Verzeichnis der Tabellen und Übersichten 101
7.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 102
7,4, Zum Autor 103
7. ANHANG
7.1 Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1: Standard-MEA Seite 7
Abb. 2: TiN-Elektroden und ihre Leitungen in die Peripherie im 8 * 8 Elektrodenfeld eines Standard-MEA. Seite 7
Rechts: TiN-Elektrode und ein Ausschnitt ihrer Mikrostruktur
Abb. 3: Vergleich einer intrazellulären Spannung und ihrer korrespondierenden extrazellulären Spannung: Seite 8
Gauss-ähnliches Membranpotential einer Voltage-Clamp-Messung und MEA-Aufnahme der
korrespondierenden extrazellulären Spannung sowie erste Ableitung des Membranpotentials, (aus Stett et
al. 2003)
Abb. 4: Differenzierung eines intrazellulären Signals über der Zeit: Erste bis dritte Ableitung des Signals Seite 9
über der Zeit (aus Connolly et al. 1990)
Abb. 5: Fortleitung eines Aktionspotentials entlang eines Axons (Johnston und Wu 1995) Seite 9
Abb. 6: Ein gemessenes Signal als Abbild des Urprungssignals der Zellen bzw. Zellschichten. Seite 10
Beeinflussung des Signals durch verschiedene Parameter der Signalkaskade, (nach Stett et al. 2003)
Abb. 7: Planares Multi-Elektroden-Feld mit steriler Verschlusskappe Seite 20
Abb. 8: MEA-60-System (Schema) Seite 21
Abb. 9: MEA-60-Verstärker mit eingesetztem Multi-Elektroden-Feld vor der Montage Seite 22
Abb. 10: MEA-60-Verstärker mit eingesetztem Multi-Elektroden-Feld und Aluminium-Abdeckung nach der Seite 22
Montage
Abb. 11: MEA-60-Verstärker mit MEA Aluminiumabdeckung und Temperaturkontrolleinheit Seite 22
Abb. 12: Aufbau des „Recorder Rack" (MC Rack Software) Seite 24
Abb. 13: Aufbau des „Replayer/Analyzer Rack" (MC Rack Software) Seite 27
Abb. 14: Datenauswertung mit dem „Replayer Rack" (MC Rack Software) Seite 28
Fig. 1: PC 12-Zellkultur in kleiner Kulturfiasche Seite 30
Fig. 2: PC 12-Zellen auf MEA nach 2 Tagen Kultivierung ohne NGF Seite 31
Fig. 3: PC 12-Zellen nach Splitt ohne Trypsin-EDTA Seite 31
Fig. 4: PC 12-Zellen nach Splitt mit Trypsin-EDTA Seite 31
Fig. 5: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Nitrocellulose-Membran Seite 33
Fig. 6: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Poly-D-Lysin Seite 33
Fig. 7: PC 12-Zellen auf MEA beschichtet mit Nitrocellulose. Erste Kultur auf vorher unbenutztem MEA Seite 34
Fig. 8: MEA in der darauf folgenden Passage, ohne PC 12-Zellen - Überlappung alter und neuer Seite 34
BeSchichtung
Fig. 9: PC 12-Zellen auf Poly-D-Lysin vor dem Mediumwechsel Seite 35
Fig. 10: PC 12-Zellen auf Poly-D-Lysin nach vollständigem Mediumwechsel Seite 35
Fig. 11: Kultur von PC 12-Zellen auf einem neuen MEA Seite 35
99 Anhang
Fig. 12: PC 12-Zellen in großer Kulturflasche nach 3 Tagen Kultivierung ohne NGF und anschließender Seite 37
Differenzierung über 2 Tage mit 100 ng/ ml NGF
Fig. 13: PC 12-Zellen der 1. Zellkultur am 2. Tag der Differenzierung mit 100ng/ml NGF Seite 37
(Ausschnitt aus Fig. 12)
Fig. 14: PC 12-Zellen der 1. Zellkultur am 4. Tag der Differenzierung mit 100 ng/ ml NGF Seite 37
Fig. 15: PC 12-Zellen der 2. Zellkultur am 3. Tag der Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 38
Fig. 16: PC 12-Zellen der 2. Zellkultur am 8. Tag der Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 38
Fig. 17: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Kultur ohne Differenzierung mit NGF Seite 40
Fig. 18: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Differenzierung mit 50 ng/ml NGF Seite 40
Fig. 19: PC 12-Zellen nach 8 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml Seite 40
Fig. 20: PC 12-Zellen in Multiwellschalen nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF über 9 Tage Seite 41
Fig. 21: PC 12-Zellen in Multiwellschalen nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF über 9 Tage Seite 41
Fig. 22: Zellaggregation und -ablösung. Mitte einer PC 12-Kultur nach Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Seite 41
über 8 Tage
Fig. 23: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Kultivierung ohne NGF A: in 15% Serum. B: in Seite 44
1 % Serum
Fig. 24: Rand einer PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Kultivierung ohne NGF) A: in 15% Serum. B: in 1 % Seite 44
Serum
Fig. 25: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Kultivierung ohne NGF A: in 15% Serum. B: in 1 % Seite 45
Serum
Fig. 26: Mitte einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF Kultur in 1 % Serum Seite 45
mit NGF
Fig. 27: Rand einer PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF. A: in 15 % Serum. Seite 46
B: in 1 % Serum
Fig. 28: PC 12-Zellkultur nach 3 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF A: in 15 % Serum. B: in 1 % Seite 46
Serum. Ausdifferenzierte Zellformationen in beiden Serumkonzentrationen
Fig. 29: PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Differenzierung mit 200 ng/ml NGF. Ausgeprägtere Differenzierung Seite 47
bei Zellen, die mit 15% Serum im Medium kultiviert wurden. A: in 15 % Serum. B: in 1 % Serum.
Hochdifferenzierte PC 12-Zellen C: in 15 % Serum. D: in 1 % Serum
Fig. 30: PC 12-Zellaggregat mit bläschenförmigen Zellsomata. PC 12-Zellkultur nach 9 Tagen Seite 48
Differenzierung mit 200 ng/ml NGF und 1 % Serumkonzentration
Fig. 31: PC 12-Zellen auf MEA nach Differenzierung über 52 Stunden mit NGF 50 ng/ml Seite 49
Fig. 32: PC 12-Zellen auf MEA nach Differenzierung mit NGF über 5 Tage Seite 50
Fig. 33: PC 12-Zellen auf MEA: nach Differenzierung mit NGF. A: 2 Tage. B: 4 Tage. C: 7 Tage. Seite 51
Fig. 34: PC 12-Zellen nach Differenzierung mit NGF in A: 52 h. in B: 5 Tage Seite 52
Fig. 35 A: PC 12-Zellkultur auf MEA 3200 PC 12-Zellen/cm2 nach 4 h Wachstum in NGF-freiem Medium Seite 54
und anschließender Differenzierung mit 100 ng/ml NGF über 8 Tage. Mit Gentamicin. 10x Vergrößerung.
B: Kurz nach Entfernen des Kultumediums und Zugabe von 1 ml magnesiumfreier Extrazellulärlösung. Im
gezeigten Ausschnitt hatte sich die PC 12-Zellkultur fast vollständig abgelöst
Fig. 36: Gesamtzahl der Messungen von PC 12-Zellen auf MEA nach Anzahl der Tage unter Seite 56
Differenzierung mit NGF
Fig. 37: Rohdaten eines MEA bewachsen mit PC 12-Zellen, 10 Tage nach Differenzierung mit NGF. Seite 57
Messung in RPMI. Dargestellt ist die 3. Sekunde nach Installation des MEA im Verstärker
Anhang 100
Fig. 38: Signal einer bewachsenen MEA-Elektrode, dass sich eindeutig vom Grundrauschen abhebt Seite 60
Fig. 39: Signal auf unbewachsener MEA-Elektrode, das sich eindeutig vom Grundrauschen abhebt Seite 60
Fig. 40: Signale auf einzelnen Elektroden Seite 62
Fig. 41 :Einzelsignale Seite 63
Fig. 42: Signale in Gruppen Seite 63
Fig. 43: Anzahl der gefundenen Signale bei einem Schwellenpotential von + 5* S.D. nach der Zeit der Seite 65
Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Fig. 44: Anzahl der gefundenen Signale bei einem Schwellenpotential von - 5* S.D. nach der Zeit der Seite 66
Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Fig. 45: Signale auf MEA ohne PC 12-Zellen und mit 1ml RPMI-Standardmedium während der Messung Seite 68
Fig. 46: Störung der Rohdaten eines MEA. Sinuswellen im Frequenzbereich des Stromnetzes Seite 69
Fig. 47 MEA mit Signalen, die sich eindeutig aus dem Grundrauschen abheben. Zusätzlich überlagerte Seite 69
Störung im Sinuswellenbereich
101 Anhang
7.2 Verzeichnis der Tabellen und Übersichten
Tab. 1: Geräte Seite 12
Tab. 2: Verbrauchsmittel Seite 13
Tab. 3: Medien zur Zellkultivierung Seite 15
Tab. 4: Bestandteile und technische Daten des MEA 60 Systems Seite 20
Tab. 5: Verwendete Messschemata 1 und 2 bei Messungen mit MEA Seite 25
Tab. 6: Gesamtzahl der durchgeführten PC 12-Kulturen auf MEA Seite 32
Tab. 7: Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses der Zellzahl und der NGF-Konzentration auf die Seite 39
Differenzierung
Tab. 8 Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses der NGF-Konzentration auf die Differenzierung bei Seite 39
konstanter Zellzahl
Tab. 9: Versuchsaufbau zur Optimierung der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF Seite 42
Tab. 10: Versuchsaufbau zum Einfluss der Serumkonzentration auf die Differenzierung der PC 12-Zellen mit Seite 43
NGF
Tab. 11: Aufstellung aller gefundenen Signale mit eindeutiger Signal-to-Noise-Ratio in Abhängigkeit von den Seite 58
Einzelmessungen mit unterschiedlicher Behandlung der Kulturen bei positivem Schwellenpotential
Tab. 12: Aufstellung aller gefundenen Signale mit eindeutiger Signal-to-Noise-Ratio in Abhängigkeit von den Seite 59
Einzelmessungen mit unterschiedlicher Behandlung der Kulturen bei negativem Schwellenpotential
Tab. 13: Aufschlüsselung der gefundenen Einzelsignale bei einem Schwellenpotential von + 5* S.D. nach der Seite 65
Zeit der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Tab. 14: Aufschlüsselung der gefundenen Einzelsignale bei einem Schwellenpotential von - 5* S.D. nach der Seite 66
Zeit der Differenzierung der PC 12-Zellen mit NGF
Tab. 15: Auflistung aller eindeutig identifizierten Signale auf bewachsenen und unbewachsenen MEA. Für die Seite 67
rechte Spalte wurden die Angaben aus Tab. 11 und 12 verwendet. Die unterschiedlichen Gesamtzahlen
kommen dadurch zustande, dass gleiche Signale mit -5facher S.D. und +5facher S.D. gefunden werden
konnten, diese aber nur einfach in die Gesamtrechnung eingingen
Tab. 16: Oberflächenbeschichtungen zur Anheftung von PC 12-Zellen Sejte 75
Übersicht 1: Faktoren zur Beschichtung von MEA für eine Kultur mit PC 12-Zellen Seite 36
Übersicht 2: Bedingungen für die Differenzierung von PC 12-Zellen mit NGF auf MEA Seite 52
Übersicht 3: Faktoren mit Einfluss auf die Aggregatbildung der PC 12-Zellen auf MEA Seite 53
Übersicht 4: Voraussetzungen für Kultivierung und Differenzierung von PC 12-Zellen auf MEA Seite 55 |
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