Antiproliferative und antiinflammatorische Aktivität von mTOR-Inhibitoren: Untersuchung an humanen organspezifischen Endothelzellkulturen
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung 1
1.1 Bedeutung von mTOR-Inhibitoren und Hintergrund der Studie 1
1.2 Mammalian target of rapamycin (mTOR Signaltransduktion 5
1.2.1 Downstream mTOR-Signaltransduktionskaskade 5
1.2.2 mTOR als regulatorisches Element im Zellzyklus 9
1.2.3 mTOR als nährstoffabhängiger Komplex 10
1.3 Inhibition von mTOR durch Everolimus und Sirolimus 11
1.4 Interaktion zwischen Calcineurininhibioren und mTOR-Inhibitoren 12
II Materialien 14
II. 1 Apparative und analytische Mittel 14
11.2 Zellkulturmedien und Lösungen 17
11.3 Pharmaka 19
111.3.1 Struktur der Pharmaka 19
111.3.2 Herstellung der gebrauchsfertigen Lösungen 20
11.4 Humane Endothelzellen der Arteria coronaria 21
111.4.1 Spenderkulturen 21
m.4.2 Empfängerkulturen .: 21
III Analytische und präparative Methodik 22
III. 1 Praparation humaner Koronarendothelzellen 22
111.2 Kryokonservierung humaner Koronardendolhelzellen 23
111.3 Herstellung einer Vorkultur und Aussaat im 96-Well-System 23
111.4 Darstellung der Reinheit von Koronarendothelzellen 24
111.5 Übersicht über das Versuchsprotokoll 25
111.6 Analytische Methodik 27
in.6.1 Bestimmung der Zellzahl 27
HI.6.1.1 Messprinzip 27
m.6.1.2 Methodisches Vorgehen 27
111.6.2 3H-Methyl-Thymidin-Inkorporation als Proliferationsmarker 28
111.6.3 MTS-Reaktion zum Nachweis von Zytotoxizität 29
Inhaltsverzeichnis
111.6.4 Quantifizierung von Adhäsionsmolekülen mittels zellulärem ELISA
(E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1) 30
111.6.4.1 Vorbereitung der Messungen 30
111.6.4.2 Methodisches Vorgehen 31
111.6.5 Quantifizierung proinflammatorischer Zytokine und Chemokine im Zeiloberstand
(IL-6, IL-8 und MCP-1) 32
HI.6.5.1 ELISA für Interleukin 6 (IL-6) 32
III.6.5.2 ELISA für Interleukin 8 (IL-8) 33
HI.6.5.3 ELISA für Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) 34
IU.7 Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurven und IC50-Werte 35
III.8 Statistische Methoden 36
111.8.1 Wilcoxon Signed Rank Test 37
111.8.2 Gepaarter t-Test 38
IV Ergebnisse 39
IV.1 Kardiovaskuläre Risikofaktoren und Verwendbarkeit von kryokonservierten
Koronarendothelzellen in ex vivo in vitro Eiperimenten... 39
rv.1.1 Empfängerkulturen 39
IV.1.2 Spenderkulturen 40
IV.2 Zellproliferation in Abhängigkeit von der mTOR-Inhibition 43
IV.2.1 Effekt von mTOR-Inhibitoren auf das Zellwachstum 43
IV.2.1.1 Wachstumskinetik 43
IV.2.1.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung der Proliferationsgeschwindigkeit 53
IV.2.1.3 Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Gleichgewichtsbedingungen 54
IV.2.1.4 Vergleich der Effekte vonmTOR- und Calcineurininhibitoren 58
IV.2.2 Effekt von mTOR-Inhibitoren auf die 3H-Methyl-Thymidin-Inkorporation 59
IV.2.2.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung der
3H-Methyl-Thynüdin-Aufhahme pro Ansatz 61
IV.2.2.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung
3H-Methyl-Thytnidin-Aufhahme pro Zelle 62
IV.2.2.3 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 63
Inhaltsverzeichnis
IV J Messung der zytotoxischen Potenz von mTOR-Inhibiloren 64
IV.3.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung der MTS-Reaktion pro Ansatz 64
IV.3.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung der MTS-Reaktion pro Zelle 65
IV.3.3 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 66
IV.4 Quantifizierung der zellulären SynthesekapaziWt. 67
IV.4.1 Einfluss von mTOR-Inhibitoren auf die Expression von Adhäsionsmolekülen
(E-Selektin, ICAM-1, VCAM-1) 67
IV.4.1.1 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 69
IV.4.2 Einfluss von mTOR-Inhibitoren auf die Synthese von Zytokinen und Chemokinen 71
IV.4.2.1 Interleukin-8 (IL-8) 71
IV.4.2.2 Monocyte ChemoattractantProtein-1 (MCP-1) 71
IV.4.2.3 Interleukin-6 (IL-6) 72
IV.4.2.4 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 75
V Diskussion ..... 77
V.l Diskussion der Ergebnisse 78
V.2 Zusammenfassung und Ausblick 94
VI Anhang ...... 98
VI.l TNF-Signaltransduktion 98
VI.2 Steckbriefe der untersuchten Zytokine/Chemokine und Grundlagen ihrer Signalkaskaden.. 101
VI.2.1 Interleukin-6 (IL-6) 101
VI.2.2 Interleukin-8 (IL-8) 104
VI.2.3 Monocyte ChemoattractantProtein-1 (MCP-1) 106
VI.3 Grundlagen zu den Zeiladhäsionsmolekülen 108
VI.3.1 E-Selektin 108
Vl.3.2 VCAM-1 108
VI.3.3 ICAM-1 108
VII Literaturverzeichnis. 109
VIII Veröffentlichungen.. 126
IX D nks fninffeii . . im
X Curriculum vitae... 166
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung 1
1.1 Bedeutung von mTOR-Inhibitoren und Hintergrund der Studie 1
1.2 Mammalian target of rapamycin (mTOR Signaltransduktion 5
1.2.1 Downstream mTOR-Signaltransduktionskaskade 5
1.2.2 mTOR als regulatorisches Element im Zellzyklus 9
1.2.3 mTOR als nährstoffabhängiger Komplex 10
1.3 Inhibition von mTOR durch Everolimus und Sirolimus 11
1.4 Interaktion zwischen Calcineurininhibioren und mTOR-Inhibitoren 12
II Materialien 14
II. 1 Apparative und analytische Mittel 14
11.2 Zellkulturmedien und Lösungen 17
11.3 Pharmaka 19
111.3.1 Struktur der Pharmaka 19
111.3.2 Herstellung der gebrauchsfertigen Lösungen 20
11.4 Humane Endothelzellen der Arteria coronaria 21
111.4.1 Spenderkulturen 21
m.4.2 Empfängerkulturen .: 21
III Analytische und präparative Methodik 22
III. 1 Praparation humaner Koronarendothelzellen 22
111.2 Kryokonservierung humaner Koronardendolhelzellen 23
111.3 Herstellung einer Vorkultur und Aussaat im 96-Well-System 23
111.4 Darstellung der Reinheit von Koronarendothelzellen 24
111.5 Übersicht über das Versuchsprotokoll 25
111.6 Analytische Methodik 27
in.6.1 Bestimmung der Zellzahl 27
HI.6.1.1 Messprinzip 27
m.6.1.2 Methodisches Vorgehen 27
111.6.2 3H-Methyl-Thymidin-Inkorporation als Proliferationsmarker 28
111.6.3 MTS-Reaktion zum Nachweis von Zytotoxizität 29
Inhaltsverzeichnis
111.6.4 Quantifizierung von Adhäsionsmolekülen mittels zellulärem ELISA
(E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1) 30
111.6.4.1 Vorbereitung der Messungen 30
111.6.4.2 Methodisches Vorgehen 31
111.6.5 Quantifizierung proinflammatorischer Zytokine und Chemokine im Zeiloberstand
(IL-6, IL-8 und MCP-1) 32
HI.6.5.1 ELISA für Interleukin 6 (IL-6) 32
III.6.5.2 ELISA für Interleukin 8 (IL-8) 33
HI.6.5.3 ELISA für Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) 34
IU.7 Berechnung der Dosis-Wirkungs-Kurven und IC50-Werte 35
III.8 Statistische Methoden 36
111.8.1 Wilcoxon Signed Rank Test 37
111.8.2 Gepaarter t-Test 38
IV Ergebnisse 39
IV.1 Kardiovaskuläre Risikofaktoren und Verwendbarkeit von kryokonservierten
Koronarendothelzellen in ex vivo in vitro Eiperimenten. 39
rv.1.1 Empfängerkulturen 39
IV.1.2 Spenderkulturen 40
IV.2 Zellproliferation in Abhängigkeit von der mTOR-Inhibition 43
IV.2.1 Effekt von mTOR-Inhibitoren auf das Zellwachstum 43
IV.2.1.1 Wachstumskinetik 43
IV.2.1.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung der Proliferationsgeschwindigkeit 53
IV.2.1.3 Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Gleichgewichtsbedingungen 54
IV.2.1.4 Vergleich der Effekte vonmTOR- und Calcineurininhibitoren 58
IV.2.2 Effekt von mTOR-Inhibitoren auf die 3H-Methyl-Thymidin-Inkorporation 59
IV.2.2.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung der
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IV.2.2.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung
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IV.2.2.3 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 63
Inhaltsverzeichnis
IV J Messung der zytotoxischen Potenz von mTOR-Inhibiloren 64
IV.3.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung der MTS-Reaktion pro Ansatz 64
IV.3.2 Dosis-Wirkungs-Beziehung der MTS-Reaktion pro Zelle 65
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IV.4.2.4 Vergleich der Effekte von mTOR- und Calcineurininhibitoren 75
V Diskussion . 77
V.l Diskussion der Ergebnisse 78
V.2 Zusammenfassung und Ausblick 94
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VI.l TNF-Signaltransduktion 98
VI.2 Steckbriefe der untersuchten Zytokine/Chemokine und Grundlagen ihrer Signalkaskaden. 101
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