Mitochondriale Toxizität unter HAART (Highly Active Antiretroviral therapy): quantitativer und qualitativer Effekt antiretroviraler Substanzen auf Mitochondrien in vivo und in vitro
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2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis:
1. Einleitung 1
1.1 Epidemiologie HIV und AIDS I
1.2 Geschichtlicher Überblick 3
1.2.1 HIV und AIDS 3
1.2.2 Antiretrovirale Therapie der HIV-Infektion 3
1.3 Pathogenese und Klinische Manifestation der HIV-Infektion 4
1.4 Therapie der HIV-Infektion 7
1.4.1 Allgemein 7
1.4.2 Einteilung und Wirkungsweise der HAART-Substanzklassen 9
1.4.2.1 Nukleosid-/ Nukleotidartige Reverse Transkriptase Hemmer (NRTI, NtRTI) 10
1.4.2.2 Nicht-Nukleosidartige Reverse Transkriptase Hemmer (NNRTI) 11
1.4.2.3 Proteaseinhibitoren (PI) 12
1.4.2.4 Neue Therapiewege/Substanzklassen 12
1.5 Nebenwirkungen der HAART 13
1.5.1 Mitochondriale Toxizität 13
1.5.1.1 Das Mitochondrium 14
1.5.1.2 Pathogenese der mitochondrialen Toxizität 16
1.5.2 Hyperlaktatämie und Laktatazidose als klinisches Auswirkung der 18
Mitochondrialen Toxizität
2. Material und Methoden 21
2.1 Material 21
2.1.1 Geräte 21
2.1.2 Materialien und Chemikalien 21
2.1.3 Zellkulrur 23
2.1.3.1 Zelllinie 23
2.1.3.2 Medien und Zusatzlösungen 23
2.1.3.3 Antiretrovirale Stocklösungen 23
2.2 Methoden 25
2.2.1 Vorbemerkung 25
2.2.2 Allgemein 26
2.2.2.1 Extraktion von peripheren mononukieären Blutzellen (PBMCs) aus Vollblut 26
(Ficoll-Präparation)
2.2.2.2 DNA Extraktion mittels QIAamp® DNA Blood Mini Kit 26 :
2.2.2.3 Photometrische Bestimmung der Gesamt-DNA-Konzentration 27
2.2.2.4 Analyse des Verhältnisses von mitochondrialer zu nuklearer DNA 28
(mtDNA:nDNA Ratio) mittels RealTime PCR ;
2.3 Patientenstudien 31 ;
2.3.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNA:nDNA Ratio 31 ¦
mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
2.3.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 33
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel •
2.4 Zellkultur 35 ;
2.4.1 Wachstums-und Arbeitsbedingungen 35
2.4.2 Kultivierung und Züchtung von THP-1 Zellen 35
2.4.3 Inkubation und Stimulation der THP-1 Zellen mit antiretroviralen Substanzen 36
2.4.4 Bestimmung der zytotoxischen Wirkung antiretroviraler Substanzen 36
und der Proliferation unter antiretroviralem Einfluss
2.4.5 DNA-Extraktion aus THP4 Zellen 37
2.4.6 Analyse des Verhältnisses von mitochondrialer zu nuklearer DNA 38
(mtDNAmDNA Ratio) nach Inkubation mit antiretroviralen Substanzen
in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
2.4.7 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (Avy) nach 38
Inkubation mit antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels JC-1 Färbung
2.5 Statistische Auswertung 40
3. Fragestellung und Zielsetzung 41
4. Ergebnisse 44
4.1 Patientenstudien
4.1.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNAtnDNA Ratio 44
mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
4.1.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 50
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel
4.1.2.1. Patientenparameter 50 ,
4.1.2.2 mtDNA.nDNA Ratio in PBMCs 51
4.2 Zellkulturexperimente 53
4.2.1 Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von antiretroviralen Substanzen 53
und der Proliferation unter antiretroviralem Einfluss
4.2.2 Analyse des Verhältnisses zwischen mitochondrialer DNA zu 53
nuklearer DNA (mtDNA:nDNA Ratio) nach Inkubation mit
antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
4.2.2.1 Messung der mtDNA:nDNA Ratio in THP-1 Zellen nach einer Inkubation 54
mit 5uM Konzentration der jeweiligen antiretroviralen Reinsubstanz
4.2.2.2 Messung der mtDNA:nDNA Ratio in THP-1 Zellen nach einer Inkubation 56
mit 0,05uM Konzentration der jeweiligen antiretroviralen Reinsubstanz
4.2.3 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (y) nach Inkubation 59
mit anitretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels JC-1 Färbung
4.2.3.1 Analyse der mitochondrialen Funktionsleistung in THP-1 Zellen mittels 59
Messung des mitochondrialen Membranpotentials nach der Inkubation
mit 5uM Konzentration der jeweiligen Reinsubstanz
4.2.3.2 Analyse des mitochondrialen Funktionsverlustes in THP-1 Zellen mittels 62
Messung des mitochondrialen Membranpotentials nach der Inkubation
mit 0,05uM Konzentration der jeweiligen Reinsubstanz
5. Diskussion 65
5.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNA:nDNA 65
Ratio mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
5.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 67
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel
5.3 Analyse des Verhältnisses zwischen mitochondrialer DNA zu 71
nuklearer DNA (mtDNA:nDNA Ratio) nach Inkubation mit
antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
5.4 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (Ay) nach 72
Inkubation mit antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels JC-1 Färbung
6. Zusammenfassung 76
7. Literaturverzeichnis 80
8. Anhang 97
9. Danksagung 99
10. Lebenslauf 100
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis:
1. Einleitung 1
1.1 Epidemiologie HIV und AIDS I
1.2 Geschichtlicher Überblick 3
1.2.1 HIV und AIDS 3
1.2.2 Antiretrovirale Therapie der HIV-Infektion 3
1.3 Pathogenese und Klinische Manifestation der HIV-Infektion 4
1.4 Therapie der HIV-Infektion 7
1.4.1 Allgemein 7
1.4.2 Einteilung und Wirkungsweise der HAART-Substanzklassen 9
1.4.2.1 Nukleosid-/ Nukleotidartige Reverse Transkriptase Hemmer (NRTI, NtRTI) 10
1.4.2.2 Nicht-Nukleosidartige Reverse Transkriptase Hemmer (NNRTI) 11
1.4.2.3 Proteaseinhibitoren (PI) 12
1.4.2.4 Neue Therapiewege/Substanzklassen 12
1.5 Nebenwirkungen der HAART 13
1.5.1 Mitochondriale Toxizität 13
1.5.1.1 Das Mitochondrium 14
1.5.1.2 Pathogenese der mitochondrialen Toxizität 16
1.5.2 Hyperlaktatämie und Laktatazidose als klinisches Auswirkung der 18
Mitochondrialen Toxizität
2. Material und Methoden 21
2.1 Material 21
2.1.1 Geräte 21
2.1.2 Materialien und Chemikalien 21
2.1.3 Zellkulrur 23
2.1.3.1 Zelllinie 23
2.1.3.2 Medien und Zusatzlösungen 23
2.1.3.3 Antiretrovirale Stocklösungen 23
2.2 Methoden 25
2.2.1 Vorbemerkung 25
2.2.2 Allgemein 26
2.2.2.1 Extraktion von peripheren mononukieären Blutzellen (PBMCs) aus Vollblut 26
(Ficoll-Präparation)
2.2.2.2 DNA Extraktion mittels QIAamp® DNA Blood Mini Kit 26 :
2.2.2.3 Photometrische Bestimmung der Gesamt-DNA-Konzentration 27
2.2.2.4 Analyse des Verhältnisses von mitochondrialer zu nuklearer DNA 28
(mtDNA:nDNA Ratio) mittels RealTime PCR ;
2.3 Patientenstudien 31 ;
2.3.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNA:nDNA Ratio 31 ¦
mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
2.3.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 33
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel •
2.4 Zellkultur 35 ;
2.4.1 Wachstums-und Arbeitsbedingungen 35
2.4.2 Kultivierung und Züchtung von THP-1 Zellen 35
2.4.3 Inkubation und Stimulation der THP-1 Zellen mit antiretroviralen Substanzen 36
2.4.4 Bestimmung der zytotoxischen Wirkung antiretroviraler Substanzen 36
und der Proliferation unter antiretroviralem Einfluss
2.4.5 DNA-Extraktion aus THP4 Zellen 37
2.4.6 Analyse des Verhältnisses von mitochondrialer zu nuklearer DNA 38
(mtDNAmDNA Ratio) nach Inkubation mit antiretroviralen Substanzen
in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
2.4.7 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (Avy) nach 38
Inkubation mit antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels JC-1 Färbung
2.5 Statistische Auswertung 40
3. Fragestellung und Zielsetzung 41
4. Ergebnisse 44
4.1 Patientenstudien
4.1.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNAtnDNA Ratio 44
mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
4.1.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 50
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel
4.1.2.1. Patientenparameter 50 ,
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4.2 Zellkulturexperimente 53
4.2.1 Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von antiretroviralen Substanzen 53
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4.2.2 Analyse des Verhältnisses zwischen mitochondrialer DNA zu 53
nuklearer DNA (mtDNA:nDNA Ratio) nach Inkubation mit
antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
4.2.2.1 Messung der mtDNA:nDNA Ratio in THP-1 Zellen nach einer Inkubation 54
mit 5uM Konzentration der jeweiligen antiretroviralen Reinsubstanz
4.2.2.2 Messung der mtDNA:nDNA Ratio in THP-1 Zellen nach einer Inkubation 56
mit 0,05uM Konzentration der jeweiligen antiretroviralen Reinsubstanz
4.2.3 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (y) nach Inkubation 59
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4.2.3.1 Analyse der mitochondrialen Funktionsleistung in THP-1 Zellen mittels 59
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mit 5uM Konzentration der jeweiligen Reinsubstanz
4.2.3.2 Analyse des mitochondrialen Funktionsverlustes in THP-1 Zellen mittels 62
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mit 0,05uM Konzentration der jeweiligen Reinsubstanz
5. Diskussion 65
5.1 Einfluss von Thrombozyten auf das Messergebnis der mtDNA:nDNA 65
Ratio mittels RealTime PCR Quantifizierung in PBMCs und Vollblut
5.2 Analyse der mitochondrialen DNA-Depletion in PBMCs in 67
Abhängigkeit von Therapiestatus und Lakatspiegel
5.3 Analyse des Verhältnisses zwischen mitochondrialer DNA zu 71
nuklearer DNA (mtDNA:nDNA Ratio) nach Inkubation mit
antiretroviralen Substanzen in THP-1 Zellen mittels RealTime PCR
5.4 Analyse des Mitochondrienmembranpotentials (Ay) nach 72
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