Die Expression von c-myc während der Auswanderung von Prämyoblasten in die Gliedmaßenanlage des Vogelembryos und die Validierung von Konstrukten zur Funktionsanalyse durch RNAi:
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Gießen
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INHALTSVERZEICHNIS
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG I
INHALTSVERZEICHNIS II
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV
1. EINLEITUNG 1
1.1 MYC 1
1.1.1 GENETISCHE ANALYSE VON C-MYC 1
1.1.2 HINTERGRUND ZUR PROTEINFUNKTION VON C-MYC 2
1.1.2.1 STRUKTUR UND FUNKTIONELLE DOMAENEN 2
1.1.2.2 DIE WIRKWEISE VON C-MYC ALS TRANSKRIPTIONSFAKTOR 3 1.1.3. DIE
FUNKTION VON C-MYC IM ZELLZYKLUS, ZEILPROLIFERATION UND
ZELLDIFFERENZIERUNG 5
1.2 SOMITOGENESE UND MYOGENESE IM VOGELEMBRYO 9
1.3 DAS PRINZIP DER RNA INTERFERENZ 11
1.4 FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 13
2. MATERIAL UND METHODEN 14
2.1 MATERIAL 14
2.1.1 GERAETE 14
2.1.2 LABORBEDARF 15
2.1.3 LOESUNGEN UND CHEMIKALIEN 17
2.1.4 ENZYME 28
2.1.5 SONDEN 29
2.1.6 PLASMIDE 29
2.2 TIERE 30
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 30
2.3.1 PLASMIDE ZUM KNOCKDOWN 30
2.3.2 KONSTRUKTION DER SHRNA MOLEKUELE 31
2.3.3 ANNEALING 32
2.3.4 LIGATION DER DNA FRAGMENTE 33
2.3.5 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 34
2.3.6 ANLEGEN DER BAKTERIENKULTUR 35
2.3.7 LAGERUNG EINER STAMMLOESUNG TRANSFORMIERTER ZELLEN 35 2.3.8
MINIPRAEPARATION DER PLASMIDE 36
2.3.9 ENZYMATISCHER RESTRIKTIONSVERDAU 36
2.3.10 DNA AGAROSE GELELEKTROPHORESE 37
2.3.11 MIDIPRAEPARATION DER PLASMIDE 39
2.3.12 ERMITTLUNG DER PLASMIDKONZENTRATION 40
2.4 IN OVO ELEKTROPORATION 41
2.4.1 VORBEREITUNG 41
2.4.2 OPERATIONSTECHNIK 42
2.4.3 DOKUMENTATION 43
2.5 METHODEN ZUR AUSWERTUNG DER EMBRYONEN 44
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/996008837
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
ILL
2.5.1 WHOLE-MOUNT IN-SITU HYBRIDISIERUNG 44
2.5.1.1 HERSTELLUNG DER RNA-SONDE 45
2.5.1.2 WHOLE-MOUNT IN-SITU HYBRIDISIERUNG NACH PATEL 47 2.5.1.3
WHOLE-MOUNT IN-SITU HYBRIDISIERUNG NACH BIRCHMEIER 50 2.5.1.4
WOHLE-MOUNT IN-SITU HYBRIDISIERUNG VON KONTROLLEMBRYONEN52 2.5.2
VIBRATOMSCHNITTE 52
2.5.3 FLUORESZENZ-IMMUNHISTOCHEMIE 53
2.5.4 FOTODOKUMENTATION 54
3. ERGEBNISSE 55
3.1 DAS EXPRESSIONSMUSTER VON C-MYC IN DEN SOMITEN AUF HOEHE DER
HINTEREXTREMITAETEN SOWIE IN DEN GLIEDMASSENANLAGEN 55
3.1.1 DAS EXPRESSIONSMUSTER IM STADIUM HH 17 55
3.1.2 DAS EXPRESSIONSMUSTER IM STADIUM HH 18 56
3.1.3 DAS EXPRESSIONSMUSTER IN DEN STADIEN HH 20 UND HH 21 56 3.1.4 DAS
EXPRESSIONSMUSTER IN DEN STADIEN HH 22 UND HH 23 57 3.1.5 DAS
EXPRESSIONSMUSTER IM STADIUM HH 25 57
3.1.6 DAS EXPRESSIONSMUSTER IN DEN STADIEN HH 27 BIS HH 30 58 3.2
KNOCKDOWNEXPERIMENTE VON C-MYC 68
3.2.1 NACHWEIS DES KNOCKDOWNS IM HUEHNEREMBRYO MIT HILFE VON IN-SITU
HYBRIDISIERUNG 68
3.2.2 UNTERSUCHUNG DES MIGRATIONSVERHALTENS DER MIT SHRNA-KONSTRUKTEN
TRANSFIZIERTEN ZELLEN IM HUEHNEREMBRYO 72
3.2.3 UNTERSUCHUNG DER AUSWIRKUNGEN DES KNOCKDOWNS AUF PAX3 76
4. DISKUSSION 77
4.1 DAS EXPRESSIONSMUSTER VON C-MYC IN DEN SOMITEN AUF HOEHE DER
HINTEREXTREMITAETEN SOWIE IN DEN GLIEDMASSENANLAGEN 77
4.2 KNOCKDOWNNACHWEIS VON C-MYC IM HUEHNEREMBRYO 81
4.3 DAS MIGRATIONSVERHALTEN DER MIT SHRNA-KONSTRUKTEN TRANSFIZIERTEN
ZELLEN ...82
5. ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 87
6. LITERATURVERZEICHNIS 89
7. ANHANG 95
7.1 STADIENBESTIMMUNG DER EMBRYONEN NACH HAMBURGER UND HAMILTON 95 7.2
ABBILDUNGEN DER VEKTOREN 96
7.3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 99
7.4 TABELLENVERZEICHNIS 101
8. DANKSAGUNG 102
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