Vergleichende Untersuchungen zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in Milchrinderbeständen:
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Gießen
VVB Laufersweiler
2009
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INHALTSVERZEICHNIS
/ EINLEITUNG /
2 UTERATURUEBERSICHT UEBER DIE PARATUBERKULOSE DES RINDES..2
2.1 DEFINITION UND HISTORISCHER UEBERBLICK 2
2.2 TAXONOMIE UND CHARAKTERISIERUNG VON MYCOBACTERIUM AVIUM SSP.
PARATUBERCULOSIS (MAP) 3
2.3 TENAZITAET UND INAKTIVIERUNG VON MAP 6
2.4 EPIDEMIOLOGIE 11
2.5 WIRTSSPEKTRUM 13
2.6 WIRTSCHAFTLICHE BEDEUTUNG DER PARATUBERKULOSE 14
2.7 EMPFAENGLICHKEIT UND UEBERTRAGUNGSWEGE 15
2.8 PATHOGENESE UND KLINISCHES BILD DER PARATUBERKULOSE 17
2.9 DIAGNOSTISCHE VERFAHREN 21
2.9.1 INDIREKTER ERREGERNACHWEIS 21
2.9.2 DIREKTER ERREGERNACHWEIS 25
2.9.2.1 MIKROSKOPISCHER ERREGERNACHWEIS 25
2.9.2.2 KULTURELLER ERREGERNACHWEIS 26
2.9.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHER ERREGERNACHWEIS 29
2.10 THERAPIE UND BEKAEMPFUNG DER PARATUBERKULOSE 36
2.11 MAP UND MORBUS CROHN (MC)? 41
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 43
3.1 ARBEITSKONZEPT 43
3.2 MATERIAL UND METHODEN 44
3.2.1 VERZEICHNIS DER VERWENDETEN MATERIALIEN 44
3.2.2 REFERENZ- UND KONTROLLSTAEMME 46
3.2.3 RINDERKOTPROBEN 46
3.2.4 ZIEHL-NEELSEN-FAERBUNG 47
3.2.5 DEKONTAMINATIONSVERFAHREN ZUR KULTURELLEN ANZUECHTUNG VON
MYCOBACTERIUM AVIUM SSP. PARATUBERCULOSIS (MAP) AUS RINDERKOT 48
3.2.6 NAEHRMEDIEN FUER DEN MIKROBIELLEN NACHWEIS UND DIE ANZUECHTUNG VON
MAP 49
3.2.6.1 HERROLD S EGG YOLK-SCHRAEGNAEHRMEDIUM MIT MYCOBACTIN J, ARTIKELNR.
222232,
FA. BECTON DICKINSON (BD*) 49
3.2.6.2 ENCLIT-SCHRAEGNAEHRMEDIUM, FA. ARTELT-ENCLIT 49
3.2.6.3 MIDDLEBROOK7H10-FESTNAEHRMEDIUM 50
3.2.6.4 MIDDLEBROOK7H9-F!UESSIGNAEHRMEDIUM 52
3.2.6.5 MG1T (MYCOBACTERIAL GROWTH INDICATOR TUBE)-FLUESSIGNAEHRMEDIUM,
ARTIKELNR. 245113, FA. BECTON DICKINSON (BD) 53
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/995997667
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
3.2.7 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MYCOBACTERIUM AVIUM SSP.
PARATUBERCULOSIS (MAP) 54
3.2.7.1 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MAP AUS RINDERKOT AUF HERROLD S EGG
YOLK- SCHRAEGNAEHR MEDIUM 54
3.2.7.2 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MAP AUS RINDERKOT AUF ENCLIT-
SCHRAEGNAEHRMEDIUM 55
3.2.7.3 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MAP AUS RINDERKOT AUF MIDDLEBROOK
7H10- FESTNAEHRMEDIUM 56
3.2.7.4 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MAP IN MIDDLEBROOK
7H9-FLUESSIGNAEHRMEDIUM 56
3.2.7.5 KULTURELLE ANZUECHTUNG VON MAP IN MGIT-FLUESSIGNAEHRMEDIUM 57
3.2.8 ARCHIVIERUNG VON MAP-ISOLATEN AUS RINDERKOTPROBEN 57
3.2.8.1 LYOPHILISIERUNG 58
3.2.8.2 GEFRIERKULTUREN 58
3.2.9 EXTRAKTION GENOMISCHER DNA AUS MYKOBAKTERIENKULTUREN 59
3.2.10 EXTRAKTION GENOMISCHER DNA AUS RINDERKOTPROBEN 60
3.2.10.1 DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN I (Q) 60
3.2.10.2 DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN II (QM) 61
3.2.10.3 DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN III (R) 62
3.2.10.4 DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN IV (RM) 63
3.2.11 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS VON MYCOBACTERIUM AVIUM SSP.
PARATUBERCULOSIS
AUS RINDERKOT 64
3.2.11.1 REAL-TIME POLYMERASEKETTENREAKTION 64
3.2.11.2 KONVENTIONELLE NESTED-POLYMERASEKETTENREAKTION (NPCR) 68
3.2.11.3 VORVERSUCH: EINMISCHVERSUCHE 1, 2 UND 3 - MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN VON ARTIFIZIELL KONTAMINIERTEN RINDERKOTPROBEN UNTER
BERUECKSICHTIGUNG EINES STANDARDISIERTEN DNA-EXTRAKTIONSVERFAHRENS DER
FIRMA QIAGEN 73
3.2.12 HAUPTVERSUCH I: EINMISCHVERSUCHE 4, 5 UND 6 -
MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN VON ARTIFIZIELL KONTAMINIERTEN
RINDERKOTPROBEN UNTER BERUECKSICHTIGUNG DER VIER UNTERSCHIEDLICHEN
DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN Q, QM, R UNDRM 75
3.2.13 HAUPTVERSUCH II: KULTURELLE, MIKROSKOPISCHE UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG VON NATIVEN RINDERKOTPROBEN 77
ERGEBNISSE 79
4.1 ERGEBNISSE DES VORVERSUCHES MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN -
EINMISCHVERSUCHE 1, 2 UND 3 79
4.2 ERGEBNISSE DES HAUPTVERSUCHES I: ERGEBNISSE DER
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
UNTERSUCHUNGEN - EINMISCHVERSUCHE 4 ,5 UND 6.... 81
4.2. 1 ERGEBNISSE DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DES
EINMISCHVERSUCHES 4 82
4.2.2 ERGEBNISSE DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DES
EINMISCHVERSUCHES 5 87
4.2.3 ERGEBNISSE DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DES
EINMISCHVERSUCHES 6 92
4.2.4 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER EINMISCHVERSUCHE 4, 5 UND 6 96
4.3 ERGEBNISSE DES HAUPTVERSUCHES II » 102
VI
IMAGE 3
4.3.1 ERGEBNISSE DER KULTURELLEN ANZUECHTUNG DER RINDERKOTPROBEN 102
4.3.2 ERGEBNISSE DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DER
RINDERKOTPROBEN 107
5 DISKUSSION 111
5.1 ANALYSE DES VORVERSUCHES (EINMISCHVERSUCHE 1, 2 UND 3) 112
5.2 ANALYSE DES HAUPTVERSUCHES I (EINMISCHVERSUCHE 4,5 UND 6) 115
5.3 ANALYSE DES HAUPTVERSUCHES II 120
5.3.1 BEWERTUNG DER KULTURELLEN UNTERSUCHUNGEN DES HAUPTVERSUCHES II 120
5.3.2 BEWERTUNG DER MIKROSKOPISCHEN UNTERSUCHUNGEN DES HAUPTVERSUCHES II
127
5.3.3 BEWERTUNG DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DES
HAUPTVERSUCHES II 128
6 ZUSAMMENFASSUNG 135
7 SUMMARY 136
8 ANHANG 137
8.1 FLIESSDIAGRAMME 138
8.1.1 FLIESSDIAGRAMM 1 : SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DEKONTAMINATION VON
RINDERKOT IN ANLEHNUNG AN DIE AVID-METHODE (AVID VIL /1996) 138
8.1.2 FLIESSDIAGRAMM 2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DNA-EXTRAKTION AUS
MYKOBAKTERIENKULTUREN MITTELS KONVENTIONELLEM KITSYSTEM (DNEASY BLOOD &
TISSUE KIT* DER FA. QIAGEN) 139
8.1.3 FLIESSDIAGRAMM 3: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DNA-EXTRAKTION AUS
RINDERKOT MITTELS STANDARD-DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN Q (QIAAMP DNA SLOOL
MINI KIT DER FA. QIAGEN) 141
8.1.4 FLIESSDIAGRAMM 4: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DNA-EXTRAKTION AUS
RINDERKOT MITTELS MODIFIZIERTEM DNA-EXTRAKTIONS VERFAHREN QM (QIAAMP DNA
STOOL MINI KIT DER FA. QIAGEN) 143
8.1.5 FLIESSDIAGRAMM 5: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DNA-EXTRAKTION AUS
RINDERKOT MITTELS STANDARD SOWIE MODIFIZIERTEM DNA-EXTRAKTIONSVERFAHREN
R UND RM (HIGH PURE PCR TEMPLATE PREPARATION KIT DER FA. ROCHE UNTER
VERWENDUNG DES S T A R. PUFFERS) 146
8.1.6 FLIESSDIAGRAMM 6: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG ZUR ARTIFIZIEUEN
KONTAMINATION VON RINDERKOTPROBEN MIT MAP (EINMISCHVERSUCHE I, 2 UND 3)
148
8.1.7 FLIESSDIAGRAMM 7: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG ZUR ARTIFIZIEUEN
KONTAMINATION VON RINDERKOTPROBEN MIT MAP IM HAUPTVERSUCH I
(EINMISCHVERSUCHE 4, 5 UND 6) 149
8.2 ERGEBNISTABELLEN 150
9 LITERATURVERZEICHNIS 170
VII
|
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