Untersuchungen zur Immunogenität verschiedener äußerer Membranproteine von Brachyspira hyodysenteriae im Zellkultur-Adhärenz-Modell:
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Gießen
VVB Laufersweiler
2009
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN IV
1 EINLEITUNG 1
2 SCHRIFTTUM 3
2.1 DIE SCHWEINEDYSENTERIE (SD) 3
2.1.1 AETIOLOGIE 3
2.1.2 EPIDEMIOLOGIE 4
2.1.3 PATHOGENESE 6
2.1.3.1 VERLAUF DER INFEKTION 6
2.1.3.2 ADHAERENZ DER BRACHYSPIREN AN EPITHELZELLEN 7
2.1.4 KLINIK UND PATHOLOGIE 9
2.1.5 THERAPIE UND ERADIKATION 10
2.1.6 VERSUCHE ZUR VAKZINATION GEGEN DIE DYSENTERIE 11
2.1.7 BAKTERIELLE ADHAERENZ AN EPITHELZELLEN UND AEUSSERE MEMBRANPROTEINE
VON
BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE 12
3 MATERIAL UND METHODEN 16
3.1 MATERIALIEN 16
3.1.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND PUFFER 16
3.1.2 BAKTERIENSTAEMME 16
3.1.3 GENTECHNISCH VERAENDERTE MIKROORGANISMEN (GVOS) 16
3.1.4 PLASMIDE 18
3.1.5 ZELLLINIEN 19
3.1.6 TIERE 19
3.2 BAKTERIOLOGISCHE METHODEN 19
3.2.1 ANZUCHT VON BAKTERIEN 19
3.2.2 KEIMZAHLBESTIMMUNG 20
3.2.3 REINHEITSKONTROLLE 21
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 21
3.3.1 PRAEPARATION VON DNS AUS BAKTERIENKULTUREN 21
3.3.2 DNS-BESTIMMUNG 21
3.3.3 RESTRIKTION VON DNS 21
3.3.4 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 22
3.3.5 PRIMER 23
3.3.6 AGAROSEGELELEKTROPHONESE 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/995997225
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
II INHALTSVERZEICHNIS
3.3.7 DNS-KLONIERUNG 25
3.3.8 DNS-SEQUENZIERUNG 26
3.4 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 26
3.4.1 BESTIMMUNG DER GEWONNENEN PROTEINKONZENTRATION 26
3.4.2 SDS-PAGEFSDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE) 26
3.4.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEN
PROTEINEN 27
3.5 SEROLOGISCHE METHODEN 28
3.5.1 KONJUGATE 28
3.5.2 WESTERNBLOT / IMMUNOBLOT 28
3.6 ZELLKULTURMETHODEN 29
3.6.1 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 29
3.6.2 STUDIUM DER ADHAERENZ VON B. HYODYSENTERIAE AN DARMEPITHELZELLEN 30
3.7 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 32
3.7.1 TIERHALTUNG 32
3.7.2 HERSTELLUNG DER IMPFSTOFFE 32
3.7.3 HERSTELLUNG ROMP-SPEZIFISCHER ANTISEREN IM KANINCHEN 33
3.8 DATENHALTUNG UND AUSWERTUNG 34
3.8.1 BILDDOKUMENTATION UND AUSWERTUNG 34
3.8.2 AUSWERTUNG VON DNS-SEQUENZDATEN 34
3.8.3 STATISTISCHE AUSWERTUNG 34
4 ERGEBNISSE 35
4.1 VORKOMMEN DER FUER AEUSSERE MEMBRANPROTEINE KODIERENDEN GENE (BHLP16,
BHLP29,7D, BHMP39F UND BHMP39H) BEI VERSCHIEDENEN REFERENZSTAEMMEN
DIESER SPEZIES 35
4.2 REKOMBINANTE HERSTELLUNG DER PROTEINE BHLP16, BHLP29,7D, BHMP39F UND
BHMP39H 36
4.2.1 KLONIENJNG DER GENE BHLP16, BHLP29,7D, BHMP39F UND BHMP39H IN
ECO//
BLR(DE3) 36
4.2.2 ERGEBNISSE DER PROTEINEXPRESSION UND -AUFREINIGUNG 39
4.2.3 OPTIMIERUNG DER PROTEINEXPRESSION 46
4.2.4 PROTEINGEHALTE DER ROMP-PRAEPARATIONEN 48
4.3 ERGEBNISSE DER IMMUNISIERUNGSVERSUCHE 48
4.3.1 NACHWEIS DER ROMP-SPEZIFLSCHEN ANTIKOERPER BEIM KANINCHEN 48
4.3.2 OMP-DETEKTION IN GANZZELLLYSATEN VON B. HYODYSENTERIAE DURCH DIE
ROMP- SPEZI-FISCHEN ANTISEREN 50
4.3.3 OMP-DETEKTION IN GANZZELLLYSATEN DER B. HYODYSENTERIAE -
SEROTYP-REFERENZ- STAEMME 1-9 DURCH DIE ROMP-SPEZIFISCHEN ANTISEREN VOM
KANINCHEN 52
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
4.4 ADHAESIONSVERSUCHE 56
4.4.1 ADHAESION DER BRACHYSPIREN AN DARMEPITHELZELLLINIEN VON SCHWEIN,
RATTE UND
MENSCH 56
4.4.2 HEMMUNG DER ADHAERENZ VON B. HYODYSENTERIAE-STAMM B204 DURCH
REKONVALESZENTENSEREN VON SCHWEINEN UND GANZZELLLYSATE VON IEC-18 UND
IPEC-J2-ZELLEN 56
4.4.3 HEMMUNG DER ADHAESION VON B. HYODYSENTERIAE (STAMM B204) AN
IPEC-J2- ZELLEN NACH VORINKUBATION MIT DEN ROMP-SPEZIFISCHEN ANTISEREN
VOM
KANINCHEN 60
4.4.4 HEMMUNG DER ADHAESION DER NEUN B. HYODYSENTERIAE
SEROTYP-REFERENZSTAEMME
AN IPEC-J2-2ELLEN DURCH ANTI-RBHLP16 (CH078) PLUS ANTI-RBHMP39F (CH080)
63
5 DISKUSSION 66
6 ZUSAMMENFASSUNG 74
SUMMARY 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 78
8 ANHANG 87
9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 91
9.1 ABBILDUNGEN 91
9.2 TABELLEN 93
DANKSAGUNG 95
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