Die Bedeutung des Transporters SOAT (SLC10A6) für die Entwicklung von Estrogen-abhängigen Mammakarzinomen:
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Gießen
VVB Laufersweiler
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKURZUNAEN GENETISCHER CODE
1. EINLEITUNA
2. LITERATURUEBERSICHT
2.1 ESTROAENSVNTHESE BEI DER FRAU
2.2 MAMMAKARZINOM
2.2.1 ALLAEMEINE GENESE
2.2.2 FORM, VERLAUF UND BEDEUTUNA DES BRUSTKREBSES
2.3 INTRAKRINOLOAIE
2.3.1 ESTROAENREZEPTOREN
2.3.2 STEROIDE SULFATASE (STS)
2.3.3 AROMATASE
2.3.4 17SS-HYDROXYSTEROIDDEHYDROAENASE (17SSHSD)
2.3.5 3SS-HVDROXVSTEROIDDEHYDROAENASE
2.4 PRINZIPIEN DES MEMBRANTRANSPORTS
2.5 DIE SUPERFAMILIE DER SOLUTE CARRIER (SLC)
2.5.1 DIE SOLUTE CARRIER-FAMILIE 10 (SLC10)
2.5.2 DER NATRIUMABHANGIGE STEROIDSULFATTRANSPORTER SOAT (SLC10A6)
2.6 ZELLLINIEN T47D UND MCF7
2.7 MAMMATUMORE IN DER VETERINAERMEDIZIN (HUND UND KATZE)
3. FRAAESTELLUNAEN
4. MATERIAL UND METHODEN
4.1 MATERIAL
4.1.1 CHEMIKALIEN, MEDIEN, REAGENZIEN, ENZYME UND KITS SOWIE DEREN
BEZUGSQUELLEN
4.1.2 KOMMERZIELL ERHAELTLICHE KITS
4.1.3 RADIOAKTIV-MARKIERTE CHEMIKALIEN
4.1.4 GERAETE
4.1.5 PROKARVOTISCHE UND EUKARYOTISCHE ZELLSTAEMME
4.1.6 ENZYME
4.1.7 OLIQONUKLEOTIDE
4.1.8 PLASMIDE
4.2 METHODEN
IV
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30
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31
33
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/996011994
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 34
4.2.1.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN 34
4.2.1.2 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 35
4.2.1.3 TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH GEL EXTRAKTION 35
4.2.1.4 LIGATION VON DNA 35
4.2.1.5 DIE HERSTELLUNG CHEMOKOMPETENTER BAKTERIEN (XLIOGOLD) . 35
4.2.1.6. DIE HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN (HB101) 36
4.2.1.7 KLONIERUNG DER VEKTOREN 36
4.2.1.8 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA DURCH
ELEKTROPORATION 39
4.2.1.9 ISOLIEREN DER KOLONIEN UND ANIMPFEN VON KULTUREN 40
4.2.1.10 EINFRIEREN VON TRANSFORMIERTEN BAKTERIEN 41
4.2.1.11 PLASMID-PRAEPARATIONEN IM MINI- UND MIDI-MASSSTAB 41
4.2.1.12 ETHANOL-FAELLUNG VON DNA 43
4.2.1.13 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 44
4.2.1.14 ANALYTISCHER VERDAU GEWONNENEN PLASMID-DNA ZUR
KONTROLLE DER SCHNITTMUSTER 44
4.2.1.15 ANALYSE DES RESTRIKTIONSVERDAUS MITTELS ELEKTROPHORESE _ 46
4.2.1.16 LINEARISIUERUNG DES PLASMIDS 46
4.2.1.17 PHENOLEXTRAKTION 46
4.2.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 47
4.2.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 47
4.2.2.2 PASSAGIERUNG 47
4.2.2.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 48
4.2.2.4 EINFRIEREN DER ZELLEN 48
4.2.2.5 AUFTAUEN VON ZELLEN 48
4.2.3 TRANSFEKTION DER ZELLLINIEN MCF7 UND T47D MIT DEN KONSTRUIERTEN
PLASMIDEN 49
4.2.4 STABILE TRANSFEKTION 50
4.2.5 NACHWEIS DER INTEGRATION DER VEKTOREN IN DAS GENOM 52
4.2.6 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA UND DIE POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR) 53
4.2.7 NACHWEIS DES EXPRESSION VON SOAT 55
4.2.8 RNA PRAEPARATION AUS ZELLEN 55
4.2.9 CDNA SYNTHESE REVERSE TRANSKRIPTION; VON RNA ZU CDNA SYNTHESE 56
4.2.10 REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 57
4.2.11 QUANTITATIVE RT-PCR 58
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.12 TRANSPORTASSAY IN SOAT TRANSFIZIERTEN MCF7 UND T47D MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTER SUBSTANZEN 59
4.2.13 PROLIFERATIONSASSAY BEI SOAT-TRANSFIZIERTEN MCF7 UND T47D DURCH
DEN
EINBAU VON [ 3H]THYMIDIN 62
4.2.14 HEMMUNG DER SOAT-VERMITTELTEN PROLIFERATIONSSTEIGERUNG 64
5. ERGEBNISSE 66
5.1 KLONIERUNG DER VEKTOREN 66
5.1.1 HSOATF3 66
5.1.2 SOATI2NEO4 UND SOATIKONTROLLEI NEO4 67
5.2 STABILE TRANSFEKTION DER ZELLLINIEN MCF7 UND T47D 70
5.3 NACHWEISE DER INTEGRATION DER VEKTOREN IN DAS GENOM 71
5.3.1.ERGEBNIS DER POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 71
5.3.2. REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 74
5.3.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER SOAT M RNA-EXPRESSION 75
5.4 TRANSPORTASSAY 77
5.4.1 STEROIDSULFAT-AUFNAHME IN SOAT TRANSFIZERTEN MCF7 UND
T47D ZELLEN 77
5.5 ETABLIERUNG DES PROLIFERATIONSASSAYS: BESTIMMUNG DER OPTIMALEN
BEDINGUNGEN 83
5.5.1 BESTIMMUNG DES PROLIFERATIONSVERHALTENS DER ZELLLINIEN UNTER
STEROIDSULFATEN 85
5.5.2 HEMMUNG DES SOAT-VERMITTELTEN PROLIFERATIONSSTEIGERUNG BEI
TRANSFIZIERTEN ZELLEN 91
6 DISKUSSION 98
7 ZUSAMMENFASSUNG 106
8 SUMMARY 107
9 LITERATURVERZEICHNIS 108
10 ANHANG 119
11 DANKSAGUNGEN 122
III
|
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