Untersuchungen zum immunhistologischen Nachweis verschiedener Strukturproteine des Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP)-Virus:
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Gießen
VVB Laufersweiler
2009
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURUEBERSICHT 2
2.1 AETIOLOGIE UND HISTORIE DER FELINEN INFEKTIOESEN PERITONITIS (FIP) 2
2.2 CORONAVIREN 3
2.2.1 MORPHOLOGIE UND VIRIONENSTRUKTUR 3
2.2.2 REPLIKATION UND TRANSLATION 5
2.2.3 KLASSIFIKATION 9
2.3 CORONAVIREN DER KATZE 11
2.4 FIP 12
2.4.1 EPIZOOTIOLOGIE DER FIP 12
2.4.2 KLINISCHE SYMPTOMATIK, PATHOLOGISCH-ANATOMISCHE UND HISTOLOGISCHE
BEFUNDE DER FIP.... 16 2.4.3 PATHOGENESEDERFIP 19
2.5 POSTMORTALE DIAGNOSE DER FIP 21
2.5.1 VORBEHANDLUNGEN DER ZUR IMMUNHISTOLOGIE VERWENDETEN SCHNITTE 22
2.5.2 UNSPEZIFISCHE HINTERGRUNDFAERBUNG 24
3 MATERIAL UND METHODEN 26
3.1 UNTERSUCHUNGSMATERIAL 26
3.1.1 ERHALTUNGSZUSTAND DER SEKTIONSKATZEN 27
3.2 BEARBEITUNG DER PROBEN FUER DIE HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG 27
3.2.1 FIXIERUNG UND HISTOPATHOLOGISCHE PREPARATION 27
3.3 IMMUNHISTOLOGIE 28
3.3.1 SEREN 28
3.3.1.1 KANINCHEN-, PFERDE-, RATTEN-UND SCHWEINESERUM 28
3.3.2 ANTISEREN 28
3.3.2.1 PRIMAERANTIKOERPER 28
3.3.2.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 30
3.3.2.3 TERTIAERANTIKOERPER UND DETEKTIONSSYSTEME 30
3.3.3 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DER FCOV-ANTIGENE 31
3.3.3.1 VORBEHANDLUNGEN 35
3.3.3.1.1 DAKO* TARGET RETRIEVAL SOLUTION (DTRS) 35
3.3.3.1.2 LINARIS* HISTOSAFE ENHANCER (LHE) 35
3.3.3.1.3 TARGET UNMASKING FLUID* (TUF-) BEHANDLUNG 35
3.3.3.1.4 TRYPSIN-BEHANDLUNG 36
3.3.3.1.5 ZITRAPUFFER-BEHANDLUNG 36
3.3.3.1.6 KOMBINATION DER ZITRATPURFER-BEHANDLUNG MIT DER DAKO* TARGET
RETRIEVAL SOLUTION- BEHANDLUNG ALS VORBEHANDLUNG FUER DIE INKUBATION MIT
DEM ANTIKOERPERCOCKTAIL 36 3.3.3.2 DETEKTIONSSYSTEME 38
3.3.3.2.1 PEROXIDASE-ANTI-PEROXIDASE METHODE (PAP-METHODE) 38
3.3.3.2.2 LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN-METHODE (LSAB-METHODE) 38
3.3.4 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON MYELOID/HISTIOCYTE-ANTIGEN 38
3.3.5 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS VON IMMUNGLOBULIN G 40
3.4 VERSUCHSAUF BAU 41
3.4.1 ANTIKOERPERVERSUCHSREIHE 41
3.4.2 SEMIQUANTITATIVE BEWERTUNG UND BEURTEILUNG DES EINFLUSSES
POSTMORTALER FAKTOREN AUF DIE SIGNALSTAERKE 42
3.4.3 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DER FCOV-ANTIGENE BEI FRAGLICHEN
FIP-FAELLEN 43 3.4.4 IMMUNHISTOLOGISCHE KONTROLLEN 43
3.5 KRITERIEN ZUR BEURTEILUNG DER IMMUNHISTOLOGISCHEN REAKTION 44
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/995997926
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
II INHALTSVERZEICHNIS
3.5.1 NACHWEIS VON FCOV-ANTIGEN 44
3.5.2 KRITERIEN FUER DIE BEURTEILUNG DER ANTIKOERPERVERSUCHSREIHE UND DER
SEMIQUANTITATIVEN BEWERTUNG 44
3.6 STATISTISCHE ANALYSE 45
4 ERGEBNISSE 47
4.1 ERGEBNISSE DER ANTIKOERPERVERSUCHSREIHE 48
4.1.1 VERDUENNUNG, VORBEHANDLUNG UND NACHWEISMETHODE BEI DER VERWENDUNG
DER EINZELNEN MONOKLONALEN ANTIKOERPER 48
4.1.1.1 ERGEBNISSE BEI DER VERWENDUNG DES MONOKLONALEN ANTIKOERPERS
FCV3-70 49 4.1.1.2 ERGEBNISSE BEI DER VERWENDUNG DES MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS 52D5 50 4.1.1.3 ERGEBNISSE BEI DER VERWENDUNG DES
MONOKLONALEN ANTIKOERPERS F19-1 51 4.1.1.4 ERGEBNISSE BEI DER VERWENDUNG
DES MONOKLONALEN ANTIKOERPERS 6F7 52 4.1.1.5 ERGEBNISSE BEI DER
VERWENDUNG DES MONOKLONALEN ANTIKOERPERS 1F12 53 4.1.1.6 ERGEBNISSE BEI
DER VERWENDUNG DER KOMBINATION AUSGEWAEHLTER MONOKLONALER ANTIKOERPER
(52D5, FCV3-70, F19-1 UND 1F12) ALS *COCKTAIL 54
4.2 AUSWERTUNG DES NACHWEISES DER VERSCHIEDENEN STRUKTURPROTEINE DES
FELINEN CORONAVIRUS (FCOV) 55
4.2.1 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DES N-PROTEINS MIT DEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN FCV3-70 UND 52D5 55
4.2.2 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DES M-PROTEINS MIT DEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN F19-1 UND6F7 56
4.2.2.1 MARKIERUNG VON PLASMAZELLEN DURCH DEN MONOKLONALEN ANTIKOERPER
6F7 57 4.2.3 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DES S-PROTEINS MIT DEM
MONOKLONALEN ANTIKOERPER 1F12.. 58 4.2.4 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DER
PROTEINE N, M UND S MIT DEM *COCKTAIL 59
4.3 ERGEBNISSE DER SEMIQUANTITATIVEN BEWERTUNG DER REAKTIONSINTENSITAET
UND DER BEURTEILUNG DES EINFLUSSES POSTMORTALER FAKTOREN AUF DIE
SIGNALSTAERKE 60 4.3.1 KONTROLLEN 61
4.3.1.1 POSITIVKONTROLLE 61
4.3.1.2 NEGATIVKONTROLLE 61
4.3.2 UNTERSUCHUNG DER KORRELATION DER VARIABLEN FRISCHEGRAD,
REAKTIONSINTENSITAET UND HINTERGRUNDFAERBUNG 61
4.3.2.1 EINFLUSS DES FRISCHEGRADES 61
4.3.2.2 HINTERGRUNDFAERBUNG 62
4.3.3 VERGLEICH DER UNTERSUCHTEN GRANULOME HINSICHTLICH DER
REAKTIONSINTENSITAET MIT DEN EINZELN VERWENDETEN MONOKLONALEN ANTIKOERPERN
UND DEM *COCKTAIL 62
4.3.3.1 REAKTIONSINTENSITAET 62
4.3.4 VERGLEICH DER MARKIERUNGEN VON VIRUS-STRUKTURPROTEINEN MIT
UNTERSCHIEDLICHEN MONOKLONALEN ANTIKOERPERN 63
4.4 IMMUNHISTOLOGISCHER NACHWEIS DER FCOV-ANTIGENE BEI FRAGLICHEN
FIP-FAELLEN 66
5 DISKUSSION 68
5.1 UNTERSUCHUNGSMATERIAL 68
5.2 BEMERKUNGEN ZUM AUFBAU UND ZUR AUSWERTUNG DER STUDIE 69 5.2.1
ANTIKOERPERVERSUCHSREIHE 69
5.2.1.1 AUSWAHL GEEIGNETER ANTIKOERPER UND VORBEHANDLUNGEN 69
5.2.1.2 MATERIAL UND UNTERSUCHUNGSMETHODEN 71
5.2.1.3 REAKTIONSINTENSITAET (RL) 73
5.3 INTRAZELLULAERE VERTEILUNG DER VERSCHIEDENEN STRUKTURPROTEINE 74
5.4 EINFLUESSE AUF DAS IMMUNHISTOLOGISCHE ERGEBNIS 75
5.4.1 POSTMORTATE VERAENDERUNGEN 75
5.4.2 PROTEINMENGE 76
5.4.3 EMPFINDLICHKEIT, AVIDITAET, VARIABILITAET 78
5.4.4 HINTERGRUND 79
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
5.5 EINSATZ DER UNTERSUCHTEN MONOKLONALEN ANTIKOERPER IN DER DIAGNOSTIK
80
6 ZUSAMMENFASSUNG 82
7 SUMMARY 84
8 LITERATURVERZEICHNIS 86
9 ABBILDUNGEN 104
10 ANHANG 116
10.1 TABELLEN 116
10.2 LOESUNGEN UND PUFFER 136
10.3 BEZUGSQUELLEN 138
10.4 ABKUERZUNGEN 141
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