Untersuchungen zur Expression von Connexin (Cx)43 und Connexin (Cx)45 in Sertoli-Zellen und Keimzellen in der normalen Spermatogenese, Sertoli-Zelltumoren und Seminomen des Hundes:
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| Published: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2008
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNGEN 1
2 LITERATURUEBERSICHT 3
2.1 HISTOLOGIE DES HODENS UND NORMALE SPERMATOGENESE 3
2.1.1 AUFBAU DER SAMENKANAELCHEN (TUBULI SEMINIFERI) 3
2.1.1.1 KEIMZELLEN 3
2.1.1.2 SERTOLI ZELLEN 4
2.1.1.2.1 DIFFERENZIERUNG DER SERTOLI ZELLEN 4
2.1.1.2.2 REGULATION DER DIFFERENZIERUNG UND PROLIFERATION DER SERTOLI
ZELLEN 5 2.1.1.2.3 FUNKTIONEN UND EIGENSCHAFTEN TERMINAL
DIFFERENZIERTER, ADULTER SERTOLI ZELLEN 6
2.1.1.2.4 DIFFERENZIERUNGSMARKER DER SERTOLI ZELLEN 8
2.1.1.2.5 MORPHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN DER SERTOLI ZELLE 10
2.1.2 AUFBAU DES INTERSTITIURAS 10
2.2 STOERUNGEN DER SPERMATOGENESE 10
2.2.1 HODENTUMORE 11
2.2.1.1 DAS MEHRSTUFENMODELL DER KANZEROGENESE 11
2.2.1.1.1 HUMANE HODENTUMORE 12
2.2.1.1.2 CANINE HODENTUMORE 13
23 ZELL-ZU-ZELL-VERBINDUNGEN 16
2.3.1 GAP JUNCTIONS (GJ) 16
2.3.1.1 AUFBAU UND FUNKTION DER GJ 16
2.3.1.2 CORMEXONE 18
2.3.1.3 CONNEXINE (CX) 18
2.3.1.3.1 NOMENKLATUR 18
2.3.1.3.2 PROTEINSTRUKTUR UND LOKALISATION 19
2.3.1.3.3 CX-GENE 20
2.3.1.3.4 EXPRESSION 20
2.3.1.3.5 CONNEXIN(CX)43 21
2.3.1.3.6 CONNEXIN(CX)45 22
2.3.1.4 LEBENSZYKLUS DER GJ 22
2.3.1.5 OEFFNUNGSZUSTAND DER GJ-KANAELE 24
2.3.1.6 *KNOCK-OUT UND *KNOCK-IN MAEUSE 26
2.3.1.7 FUNKTIONEN VON GJ-KANAELEN 29
2.3.1.8 GJ, CX UND TUMOR 30
2.3.2 GJ UND CX IM HODEN 32
2.3.2.1 GJ UND CX IM HODEN MIT NORMALER SPERMATOGENESE 32
2.3.2.1.1 ZELLSPEZIFISCHE EXPRESSION 33
2.3.2.1.2 ZEITLICHE EXPRESSION 34
2.3.2.1.3 VERTRETER DER CX-GEN UND PROTEINFAMILIE IM HODEN 35
2.3.2.2 GJ, CX UND IHRE FUNKTION IM HODEN 36
2.3.2.3 CX43 IM HODEN 36
2.3.2.4 CX45 IM HODEN 39
2.3.2.5 GJ UND CX IM HODEN BEI STOERUNGEN DER SPERMATOGENESE 40
2.3.2.5.1 MENSCH 40
2.3.2.5.2 HUND 41
GESCANNT DURCH
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/990148270
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
ZIELE DER ARBEIT 42
4 MATERIAL UND METHODEN 43
4.1 MATERIAL/GEWEBE 43
4.1.1 CANINE HODENGEWEBEPROBEN 43
4.1.1.1 GEWEBEENTNAHME UND KONSERVIERUNG 43
4.1.1.2 KLINISCHE DATEN 43
4.2 METHODEN 44
4.2.1 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITRPRAEPARATE FUER DIE
IMMUNHISTOCHEMIE (IHC)... 45 4.2.1.1 PARAFFINMATERIAL 45
4.2.1.1.1 VORBEMERKUNG 45
4.2.1.1.2 FIXATION IN BOUIN SCHER LOESUNG 46
4.2.1.1.3 ENTWAESSERUNG DER PROBEN 46
EINBETTUNG DER PROBEN 47
BESCHICHTUNG DER OBJEKTTRAEGER (OT) 47
HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN 47
HAEMATOXYLIN-EOSIN (H.E.)-FAERBUNG 48
4.2. 4.2. 4.2. 4.2.
4.2.1.2 4.2. 4.2. 4.2.
4.2. 4.2. 4.2.
.1.4 .1.5 .1.6 .1.7
GEFRIERMATERIAL 49
.2.1 VORBEMERKUNG 49
.2.2 OT 49
.2.3 AUFBLOCKEN DES GEWEBES 50
.2.4 HERSTELLUNG VON GEFNERSCHNITTEN FUER DIE IHC (IMMUNFLUORESZENZ) 50
.2.5 HAEMATOXYLIN-FAERBUNG 50
.2.6 FIXATION DER GEFNERSCHNITTE 50
4.2.2 IMMUNHISTOCHEMIE (IHC) 51
4.2.2.1 ALLGEMEINE VORBEMERKUNG ZUR IHC 51
4.2.2.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON SERTOLI ZELLEN
(VIMENTIN-FAERBUNG) AN PARAFFINMATERIAL 52
4.2.2.3 ANDROGENREZEPTOR-IHC AN PARAFFINMATERIAL 55
4.2.2.4 CX43-IHC AN GEFRIERMATERIAL 56
4.2.2.5 CX45-IMMUNFLUORESZENZ (IF) AN GEFRIERMATERIAL 58
4.2.2.5.1 DOPPELFAERBUNG CX45-AKTIN/ CX45-VIMENTIN 59
4.2.2.6 LICHTMIKROSKOPIE UND AUSWERTUNG DER IMMUNREAKTION 60
4.2.2.7 FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND AUSWERTUNG DER IMMUNREAKTION 60 4.2.3
EXTRAKTION UND ISOLATION VON RNA UND PROTEIN AUS GEFRIERMATERIAL 61
4.2.3.1 ALLGEMEINE VORBEMERKUNG ZUR EXTRAKTION UND ISOLATION 61
4.2.3.2 ALLGEMEINE VORBEREITUNGEN 61
4.2.3.3 EXTRAKTION 62
4.2.3.4 ISOLATION DER RNA 62
4.2.3.5 ISOLATION DER PROTEINE 64
4.2.4 NACHWEIS DER CX43-EXPRESSION UND CX45-EXPRESSION AUF PROTEINEBENE
MITTELS WESTERN BLOT (WB) 65
4.2.4.1 ALLGEMEINE VORBEMERKUNG ZUM WB 65
4.2.4.2 ALLGEMEINE VORBEREITUNGEN 66
4.2.4.3 PROBENVORBEREITUNG 66
4.2.4.4 GELELEKTROPHORESE 66
4.2.4.5 ELEKTROBLOTTING 67
4.2.4.6 NACHWEISREAKTION 68
4.2.4.7 DOKUMENTATION 71
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.5 NACHWEIS DER CX43-EXPRESSION UND CX45-EXPRESSION AUF MRNA-EBENE
MITTELS REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 71
4.2.5.1 ALLGEMEINE VORBEMERKUNG ZUR RT-PCR 71
4.2.5.2 RT-PCR AM HODENHOMOGENAT 72
4.2.5.3 RT-PCR NACH UV-LACP 77
4.2.5.4 VORBEREITUNGEN 78
4.2.5.5 ABLAUF DER UV-LACP 78
4.2.5.6 EXTRAKTION DER RNA 80
4.2.5.7 RT-PCR 82
4.2.6 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH) 84
4.2.6.1 ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN ZUR ISH 84
4.2.6.2 HERSTELLUNG DER SONDEN 84
4.2.6.3 CX43-ISH AN PARAFFINMATERIAL 91
S ERGEBNISSE 96
5.1 IMMUNHISTOCHEMIE 96
5.1.1 VIMENTIN 96
5.1.1.1 PRAEPUBERTAERE HODEN 96
5.1.1.2 NORMALE SPERMATOGENESE 97
5.1.1.3 SERTOLI ZELLTUMOR 97
5.1.1.4 SEMINOM 98
5.1.2 ANDROGENREZEPTOR 99
5.1.2.1 PRAEPUBERTAERE HODEN 99
5.1.2.2 NORMALE SPERMATOGENESE 100
5.1.3 CX43 101
5.1.3.1 PRAEPUBERTAERER HODEN 101
5.1.3.2 NORMALE SPERMATOGENESE 102
5.1.3.3 SERTOLI ZELLTUMOR 103
5.1.3.4 SEMINOM 104
5.1.4 IMMUNFLUORESZENZ (IF) CX45 105
5.1.4.1 NORMALE SPERMATOGENESE 106
5.2 WESTERN BLOT (WB) 108
5.2.1 CX43 WB 108
5.2.2 CX45 WB 1 10
53 REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 110 5.3. 1
HODENHOMOGENAT 111
5.3.2 UV-LASER ASSISTIERTE MIKRODISSEKTION 1 14
5.4 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH) 11 7
5.4.1 CX43 117
5.4.1.1 PRAEPUBERTAERE HODEN 117
5.4.1.2 NORMALE SPERMATOGENESE 118
5.4.1.3 SERTOLI ZELLTUMOR 119
5.4.1.4 SEMINOM 120
53 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE FUER CX43 . . . 122
5.6 ZUSAMMENFASSUNG DER VORLAEUFIGEN ERGEBNISSE FUER
CX45................................. 122
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
6 DISKUSSION 124
6.1 CX43 IN DER NORMALEN SPERMATOGENESE DES PRAEPUBERTAEREN UND ADULTEN
HUNDES 124
6.2 CX43 IN CANINEM SERTOLI ZELLTUMOR UND SEMINOM 127
6.3 CX45 IN DER NORMALEN SPERMATOGENESE DES ADULTEN HUNDES 132
7 ZUSAMMENFASSUNG 135
8 SUMMARY 137
9 LITERATURVERZEICHNIS 139
10 BEZUGSQUELLEN 169
10.1 STOFFE UND REAGENZIEN 169
10.2 GERAETE 171
10.3 SONSTIGES MATERIAL 172
10.4 SOFTWARE 173
11 VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN 174
IV
|
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