Funktionelle Charakterisierung des granulozytären Antigens NB1 (CD177):
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Gießen
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1 Einleitung 12
1.1 Neutrophile Granulozyten und ihre Rolle im Entzündungsgeschehen. 12
1.2 Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Verankerung 18
1.2.1 Struktur und Eigenschaften des GPI-Ankers 18
1.2.2 Funktion des GPI-Ankers 20
1.3 NB1 (HNA-2a, CD177) 22
1.3.1 Phänotypische Eigenschaften 22
1.3.2 Genotypische Eigenschaften 24
1.3.3 Struktur und biochemische Eigenschaften 26
1.3.4 Funktion von NB1 28
1.3.5 Die Rolle von NB1 bei verschiedenen Erkrankungen 30
1.4 Zielsetzung der Arbeit 32
2 Material und Methoden 33
2.1 Material 33
2.1.1 Antikörper 33
2.1.2 Proteine 33
2.1.3 Zellkulturmedien 34
2.1.4 Lösungen und Puffer 34
2.1.5 Chemikalien und Reagenzien 37
2.2 Methoden 42
2.2.1 Probensammlung und Probenaufbereitung 42
2.2.1.1 Isolierung von Granulozyten aus EDTA-Blut 42
2.2.1.2 Fixierung von Granulozyten 43
2.2.1.3 Herstellung von Granulozytenlysat 43
2.2.1.4 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration von
Granulozytenlysat 43
2.2.1.5 Gewinnung von Plasma 43
2.2.1.6 Kopplung des mAk 7D8 an CNBr-aktivierte Sepharose 4B 44
2.2.1.7 Isolierung von NB1 durch Immunaffinitätschromatographie 44
2.2.1.8 IgG-Aufreinigung von Plasmaproben 45
2.2.2 Phänotypische Untersuchungen 45
2.2.2.1 Quantitative Durchflusszytometrie 45
2.2.2.2 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 47
2.2.2.3 Erstellung einer Standardkurve zur Bestimmung der NB1-
Konzentration 49
2.2.2.4 Depletion von Plasma-NB1 durch Sepharose 4B 49
2.2.2.5 Ultrazentrifugation 50
2.2.2.6 Phasen-Separation mit Triton X-114 50
2.2.3 Zellkulturarbeiten 51
2.2.3.1 Allgemeine Zellkulturarbeiten 51
2.2.3.2 Auftauen von Zellen 51
2.2.3.3 Einfrieren von Zellen 51
2.2.3.4 Transfektion von CHO-Zellen 51
2.2.3.5 Kultivierung von 7D8 Hybridomzellen 52
2.2.3.6 Bestimmung der Zellzahl 52
2.2.3.7 Zellselektion mit CELLection™ Pan Mouse IgG Kit 52
2.2.3.8 Isolierung von Endothelzellen aus Nabelschnüren 53
2.2.4 Proteinanalytische Methoden 53
2.2.4.1 Herstellung biotinmarkierten Endothelzelllysats 53
2.2.4.2 Immunpräzipitation 54
2.2.4.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-
PAGE) 55
2.2.4.4 Immunoblot (Western Blot) 55
2.2.4.5 Rehybridisierung 56
2.2.4.6 Silberfärbung 56
2.2.4.7 Funktionelle Untersuchungen 57
A) In vitro Stimulationsexperiment 57
B) In vivo Stimulationsexperiment 57
2.2.4.8 Zellsortierung mit dem Durchflusszytometer 57
2.2.4.9 Quantitative Bestimmung der Burstaktivität nach Inkubation mit
Anti-NB1 Ak 58
2.2.4.10 Adhäsionstest mit Kristall-Violett-Anfärbung 58
2.2.4.11 Adhäsionstest mit Fluoreszenzmarkierung 59
2.2.5 Funktionelle Untersuchungen am Durchflusszytometer 59
2.2.5.1 Funktionelle Untersuchungen an Endothelzellen 59
2.2.5.2 Funktionelle Untersuchungen an E-Selektin 60
2.3 Statistische Auswertung 60
Q
3 Ergebnisse 61
3.1 Standardkurve 61
3.2 Etablierung des ELISA-Testsystems 63
3.3 Quantifizierung 64
3.4 Alters- bzw. geschlechtsspezifische Unterschiede 65
3.5 Heterogene Expression von NB1 66
3.5.1 Durchflusszytometrische Bestimmung der NB1-
Oberflächenexpression und-Oberflächenkonzentration 66
3.5.2 Konstanz der NB1-Expression und der NB1-Oberflächenkonzentration
69
3.5.3 Alters- bzw. geschlechtsspezifische Unterschiede der NB1-
Expression 72
3.5.4 Vergleich des NB1-Gesamtgehalts mit der NB1-Expression, der -Ober¬
flächenkonzentration und der -Gesamtoberflächenmenge 75
3.6 Untersuchungen zur löslichen Form von NB1 79
3.6.1 Depletion von NB1 aus dem Plasma durch Sepharose A 79
3.6.2 Nachweis von NB1 im Plasma mittels Immunpräzipitation 80
3.6.3 Nachweis durch Ultrazentrifugation 82
3.6.4 Biochemischer Nachweis durch Triton X-114-Trennung 83
3.6.5 Quantitative Bestimmung des NB1-Plasmagehalts 84
3.6.6 Vergleich von löslichen und zellulären NB1 87
3.6.7 NB1 im Urin 89
3.7 Untersuchungen zur NB1-Expression nach Zellstimulation 89
3.7.1 In vitro Untersuchungen 90
3.7.2 In vivo Untersuchungen 92
3.7.3 NB1 defiziente Subpopulation 94
3.8 Funktionelle Untersuchungen zu NB1 95
3.8.1 Oxidativer Burst 95
3.8.2 NB1-Counterrezeptor 97
3.8.2.1 Isolierung des NB1-Proteins mittels
Immunaffinitätschromatographie 97
3.8.2.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen 98
3.8.2.3 Zeil-Adhäsion 100
1A
3.8.2.4 Immunpräzipitationsstudien mit Endothelzellen zur Detektion
eines möglichen Partnermoleküls für NB1 102
3.8.2.5 Interaktionsstudien mit spezifischen Partnern 103
A) Interaktion zwischen NB1 und E-Selektin (CD62E) 103
B) Interaktion zwischen NB1 und PECAM-1 (CD31) 104
4 Diskussion 108
5 Zusammenfassung 120
6 Summary 121
7 Literaturverzeichnis 122
8 Anhang 134
8.1 NB1-Standardkurve 134
8.2 NB1-Phänotyp 135
8.3 Konstanz der NB1-Expression und NB1-Oberflächenkonzentration 138
8.4 NB1 -Plasmagehalt 142
8.5 In Vitro Zellstimulation 144
9 Publikationen, Vorträge und Poster 146
10 Erklärung 147
11 Danksagung 148 |
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