Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Iprovalicarb:
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2006
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG........................................................................................................1
1.1 Erste Bayer-interne Studien zur Wirkungsweise.......................................3
1.1.1 Einfluss von SZX 867 auf die Lipid-Biosynthese............................................3
1.1.1.1 Einfluss auf das Triglycerid- und Phospholipkj-Spektrum........................3
1.1.1.2 Einfluss auf die Phospholipid-Biosynthese...............................................4
1.1.2 Einfluss von SZX 867 auf die mitochondriale Atmung....................................6
1.1.3 Aufhebung der SZX 867-Wirkung durch Metabolite.......................................6
1.2 Externe Mode of Action Studien...............................................................8
1.3 Hintergrund der vorgestellten Studien.....................................................10
1.3.1 Protoplasten-Regeneration...........................................................................10
1.3.2 Proteom und Proteomics..............................................................................12
1.4 Ziel der vorgestellten Studien...................................................................13
2 MATERIAL UND METHODEN...........................................................................14
2.1 Untersuchungen zum biochemischen Wirkungsmechnisrmis...............14
2.1.1 Testpathogen...............................................................................................14
2.1.1.1 Pathogenanzucht und Erhaltung............................................................14
2.1.2 Wirkstoffe.....................................................................................................16
2.1.2.1 Iprovalicarb.............................................................................................16
2.1.2.2 Metalaxyl................................................................................................18
2.1.2.3 Proparnocarb-Hydrochlorid....................................................................18
2.1.2.4 Cymoxanil..............................................................................................18
2.1.2.5 Dimethomorph........................................................................................19
2.1.2.6 Andoprim................................................................................................19
2.1.3 In vitro Wirkung von Iprovalicarb und Vergleichsmitteln...............................20
2.1.3.1 Radialer Myzelwachstumstest................................................................20
2.1.3.2 Direkte Keimung von Zoosporangien.....................................................21
2.1.3.3 Myzelmasse in Flüssigkultur..................................................................21
2.1.3.4 Lichtmikroskopische Untersuchung der Zoosporangienkeimung...........21
2.1.4 Einfluss von Phosphatidylcholin auf das Wachstum von
Phytophthora infestans in An- und Abwesenheit
von Iprovalicarb und Vergleichspräparaten..................................................22
2.1.5 Einfluss von IprovaHcarb auf Zellkernanzahl und Zellkernverteilung............23
2.1.6 Untersuchungen an isolierten Protoplasten..................................................24
2.1.6.1 Isolierung von Protoplasten....................................................................25
2.1.6.2 Regeneration der Protoplastenzellwand................................................27
2.1.6.3 Nachweis neu gebildeter Zellulose bzw. regenerierter Zellwände..........30
2.1.6.4 Ermittlung von Protoplastendichte und Regenerationsrate....................30
2.1.6.5 Einfluss von Iprovalicarb und Vergleichspräparaten auf die
Protoplasten-Regeneration....................................................................31
2.1.7 Biochemische Studien..................................................................................32
2.1.7.1 Einflussvon Iprovalicarb auf die Glucan-Synttiase-Aktivität..................32
2.1.7.1.1 Aktivität isolierter Glucan-Synthase.................................................32
2.1.7.1.2 Einbau von C-Saccharose in säureunlösliche (Zellwand)-
Bestandteile regenerierender Protoplasten......................................34
2.1.7.2 Einfluss von Iprovalicarb auf die Nukleinsäure-Synthese.......................35
2.1.7.3 Einflussvon Iprovalicarb auf die Protein-Synthese................................36
2.1.8 Proteomics...................................................................................................37
2.1.8.1 Isoelektrische Fokussierung und 2D-Gelelektrophorese........................38
2.1.8.1.1 Zellaufschluss und Präparation der Protein-Homogenate................38
2.1.8.1.2 Isoelektrische Fokussierung (IEF-1. Dimension)..........................38
2.1.8.1.3 2D-Gelelektrophorese (SDS-PAGE-2. Dimension).......................40
2.1.8.2 Gel-Auswertung.....................................................................................43
2.2 Untersuchungen zum Sensitivitätsstatus der Zielpathogene.................44
2.2.1 Phytophthora infestans.................................................................................44
2.2.2 Plasmopara viticola......................................................................................45
3 ERGEBNISSE.....................................................................................................47
3.1 In vitro Wirkung von Iprovalicarb und Vergleichspräparaten
auf Phytophthora infestans.......................................................................47
3.1.1 Radiales Wachstum in Gegenwart von Iprovalicarb
und Vergleichspräparaten............................................................................47
3.1.2 Zoosporangienkeimung und Trockenmasse von Flüssigkulturen.................50
3.1.3 Morphologie der Zoosporangienkeimung.....................................................52
3.2 Einfluss von PhosphatkJylcholin auf das Wachstum unbehandetter
und behandelter Flüssigkulturen von Phytophthora infestans..............55
3.2.1 Unbehandelte Kulturen.................................................................................55
3.2.2 Behandelte Kulturen.....................................................................................56
3.3 Einfluss von Iprovalicarb auf ZelHcemanzahl und Zeilkernverteilung... 67
3.4 Zellwandregeneration isolierter Protoplasten.........................................69
3.4.1 Mikroskopische Untersuchungen.................................................................69
3.4.2 Einfluss von Iprovalicarb und Vergleichspräparaten auf die Anlagerung
des Ruoreszenzmarkers Blancophor in Glucane regenerierender
Protoplasten von Phytophthora infestans.....................................................76
3.5 Biochemische Studien...............................................................................79
3.5.1 Einfluss von Iprovalicarb auf die Glucan-Synthase-Aktivität.........................79
3.5.1.1 Aktivität isolierter Glucan-Synthase........................................................79
3.5.1.2 Einfluss von Iprovalicarb auf den C-Einbau aus radioaktiv
markierter Saccharose in säureunlösliche (Zellwand)-Bestandteile
regenerierender PAiyfop/itfiora-Protoplasten..........................................80
3.5.2 Einfluss von Iprovalicarb auf den Nukleinsäure-Stoffwechsel......................81
3.5.3 Einfluss von Iprovalicarb auf die Protein-Synthese......................................82
3.6 Proteomanalyse von Phytophthora infestans.........................................85
3.6.1 Qualitative Analyse.......................................................................................87
3.6.1.1 Qualitative Proteomunterschiede nach Iprovalicarb-Behandlung...........88
3.6.2 Quantitative Analyse.....................................................................................90
3.6.2.1 Quantitative Proteomunterschiede nach Iprovalicarb-Behandlung.........90
3.6.2.2 Vergleich der Proteome von Phytophthora infestans nach
Behandlung mit Iprovalicarb und Dimethomorph...................................96
3.7 Sensitivitätsstatus der Zielpathogene gegenüber Iprovalicarb...........106
3.7.1 Vorwort.......................................................................................................106
3.7.2 Monitoring-Ergebnisse Plasmopara viticola................................................107
3.7.2.1 Kreuzresistenzanalyse.........................................................................116
3.7.3 Monitoring-Ergebnisse Phytophthora infestans..........................................120
4 DISKUSSION....................................................................................................122
4.1 Biochemischer Wirkungsmechanismus von iprovalicarb....................122
4.2 Sensitivitätsstatus und ResistenzrisHco von Plasmopara viticola
und Phytophthora Infestans gegenüber Iprovalicarb...........................141
4.3 Wirkungsinechanismus und Resistenzmecnanismus..........................147
5 ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................149
6 SUMMARY........................................................................................................154
7 UTERATURVERZEJCHNfô..............................................................................159
8 ANHANG..........................................................................................................172
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