Mechanismen der Proliferation von Kardiomyozyten differenziert aus embryonalen Stammzellen der Maus:
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Gießen
VVB Laufersweiler
2007
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungen III
1 Einleitung 1
1.1 Stammzellen 1
1.2 Kardiomyozyten 4
1.3 Zellzyklus 7
1.4 kardiale Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren 9
1.5 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 10
1.5.1 NADPH-Oxidase 14
1.5.2 ROS im kardiovaskulären System 17
2 Zielsetzung der Arbeit 19
3 Material 20
3.1 Firmen 20
3.2 Geräte und Laborbedarf 21
3.3 Medien und Chemikalien 22
3.4 Antikörper 24
3.5 Primer 25
3.6 Medien, Puffer 26
3.6.1 Medien 26
3.6.2 Puffer 27
3.6.3 Substanzen 28
4 Methoden 29
4.1 Zellkultur embryonaler Stammzellen 29
4.1.1 Feeder-Zellen 29
4.1.2 Stammzellen 30
4.2 Gewinnung der Kardiomyozyten 32
4.2.1 Isolation embryonaler Kardiomyozyten aus Stammzellen: 32
4.2.2 Isolation neonataler Kardiomyozyten: 32
4.3 Behandlung der Zellen mit verschiedenen Substanzen 33
4.4 Immunzytochemische Färbungen 33
4.5 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 35
Inhaltsverzeichnis II
4.6 Konfokale Lasermikroskopie 35
4.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38
4.7.1 Isolation der RNA 38
4.7.2 cDNA-Synthese 39
4.7.3 Quantitative PCR 40
4.8 Durchflusszytometrie 41
4.9 Statistik 42
5 Ergebnisse 43
5.1 Isolation neonataler Kardiomyozyten 43
5.2 Proliferationsfähigkeit der Kardiomyozyten 45
5.3 Konzentrationsbestimmung des H2O2 51
5.4 Inkubationszeit mit H2O2 53
5.5 Stimulation der Proliferation von Kardiomyozyten durch ROS 54
5.6 Einfluss der Behandlung mit H2O2 auf die Expression der NADPH-Oxidase 60
5.7 Stimulation der Kardiomyogenese durch ROS 64
5.8 Untersuchung der Kardiomyozytenproliferation durch FACS-Analyse und
mikroskopische Bestimmung 65
5.9 Untersuchung herzspezifischer Gene 68
5.10 Redoxregulation herzspezifischer Transkriptionsfaktoren und des
Wachstumsfaktors BMP-10 69
6 Diskussion 73
7 Zusammenfassung 82
8 Summary 83
9 Literaturübersicht 84
Danksagung 103
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