Photorezeptoren und Lichteffekte in Agrobacterium tumefaciens:
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| Published: |
Berlin
Mensch-und-Buch-Verl.
2007
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung.............................................................................................................1
1.1. Photorezeptoren...........................................................................................1
1.1.1. Phytochrome.........................................................................................1
1.1.2. Pflanzliche Phytochrome.......................................................................2
1.1.3. Bakterielle Phytochrome.......................................................................3
1.1.4. Pilz-Phytochrome..................................................................................6
1.1.5. Signaltransduktion und Funktion mikrobieller Phytochrome..................7
1.1.6. Cryptochrom/Photolyase-Familie..........................................................7
1.1.7. Cryptochrome........................................................................................8
1.1.8. Photolyasen..........................................................................................9
1.2. Agrobacterium tumefaciens..........................................................................9
1.2.1. Aufbau und Funktion der Flagellen.....................................................10
1.2.2 A. fc/me/ac/ens-Pflanzen-Interaktion..................................................11
1.3. Lichtabhängige Bewegung bei Bakterien...................................................11
1.4. Ziele der Arbeit...........................................................................................12
2. Materialien und Methoden.................................................................................14
2.1. Organismen und Plasmide.........................................................................14
2.2. Chemikalien und Wasser...........................................................................15
2.3. Verwendete Oligonukleotide.......................................................................15
2.4. Bakterienanzucht........................................................................................16
2.5. Bakterientransformation.............................................................................17
2.6. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)...........................................................18
Real-Time-PCR.................................................................................................20
2.7. Restriktionsverdaue und Ligation...............................................................20
2.8. Agarose-Gel-Elektrophorese......................................................................21
2.9. Plasmid-Präparationen aus E coli.............................................................21
2.10. DNA-Isolation aus A. tumefaciens..............................................................22
2.11. DNA-Sequenzierung..................................................................................22
2.12. Southern Blots............................................................................................23
2.13. Klonierungen..............................................................................................26
2.13.1 agpr-Mutante.....................................................................................27
2.13.2 agpZ -Mutante.....................................................................................28
2.13.3 agpV/agpZ -Mutante..........................................................................29
2.13.4 cry -Mutante.......................................................................................30
2.13.5 Transposon-Mutarrten.........................................................................31
2.14. Protein-Extraktion aus A tumefaciens.......................................................33
2.14.1 Für die spektralphotometrische Phytochromcharakterisierung............33
2.14.2 Für die 2D-Gel-Elektrophorese...........................................................33
2.14.3 FOrdieFlagellen-Reinigung................................................................34
2.15. SDS-PAGE.................................................................................................34
2.16. Spektralphotometrische Phytochromcharakterisierung..............................36
2.17. 2D-Gel-Elektrophorese und Proteinidenttfizierung.....................................38
2.17.1 Erste Dimension..................................................................................38
2.17.2 Zweite Dimension................................................................................38
2.17.3 Protein-MusterrAnalyse.......................................................................40
2.17.4 Protemkterrtifizierung...........................................................................40
2.18. Mikroskopie................................................................................................41
2.19. Virulenz-Essay...........................................................................................42
3. Ergebnisse........................................................................................................43
3.1. Photorezeptor-fcnoctouf-Mutanten von A. tumefaciens..............................43
3.1.1 Phytochrom-knockout-Mutanten.........................................................43
3.1.2 CryptochronWffJocfrotrf-Mutante..........................................................46
3.2. Spektrale Charakterisierung nativer A. tumefaciens Phytochrome.............47
3.2.1 Photoreversibilität nativer Phytochrome..............................................47
3.2.2 Dunkelreversion der nativen Phytochrome..........................................51
3.3. Wachstum der Phytochrom-tooc/couf-Mutanten.........................................53
3.4. Proteom-Analysen der Phytochrom-fcroc/cotrf-Mutanten............................54
3.4.1 Vergleich des Proteinmusters von Wildtyp und Phytochrom-Änocfoirf-
Mutanten...........................................................................................................54
3.4.2 Analyse der Flagellen-Proteine...........................................................59
3.5. Lichteinfluss auf Motilität und Virulenz von A. tumefaciens........................62
3.5.1 Flagellen-Isolation und Elektronenmikroskopie...................................62
3.5.2 Transkription der fla-Gene...................................................................64
3.5.3 Beweglichkeitstest...............................................................................65
3.5.4 Lichtabhängige Virulenz......................................................................66
3.6. Perzeption des Lichts.................................................................................67
3.6.1 Photorezeptor-Mutanten.....................................................................67
3.6.2 Versuche zur spektralen Charakterisierung der Bewegung................69
3.6.3 Transposon-Mutagenese....................................................................70
3.6.4 Elektronenmikroskopie........................................................................74
4. Diskussion.........................................................................................................76
4.1. A. tumefaciens-knockout-Mutanten............................................................76
4.2. Unterschiede und Gemeinsamkeiten der nativen und rekombinanten
Phytochrome aus A. tumefaciens.........................................................................77
4.3. Phytochrom-abhängige und -unabhängige lichtregulierte A. tumefaciens
Proteine.................................................................................................................79
4.4. Licht beeinflusst Motilität und Virulenz von A. tumefaciens........................82
4.5. Ist eine Photolyase an der Regulation der Bewegung beteiligt?................85
4.6. Mögliche Funktionen der Phytochrome in A tumefaciens..........................90
5. Zusammenfassung............................................................................................92
6. Literatur.............................................................................................................94
Abkürzungen..........................................................................................................110
Anhang...................................................................................................................112
Publikationen, Vorträge und Tagungen..................................................................115
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