Untersuchungen zu dem Einfluss der zellulären Peptidylprolyl-cis-trans-Isomerase Cyclophilin A auf die Funktion des regulatorischen HIV-1 Proteins Vpr:
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1 Inhaltsverzeichnis
1 Inhaltsverzeichnis 1
2 Zusammenfassung 6
3 Einleitung 9
3.1 HIV-Infektion und AIDS 9
3.2 HIV 10
3.2.1 Virusgenom 11
3.2.2 Virusproteine und Virusaufoau 11
3.2.3 Replikationszyklus 14
3.3 Vpr 15
3.3.1 Struktur 17
3.3.2 Virusinkorporation 18
3.3.3 Funktionen und Interaktionspartner 18
3.3.3.1 Vpr und Kernimport 20
3.3.3.2 Vpr und Apoptose 21
3.3.3.3 Vpr und Zellzyklusarrest 21
3.4 Zelluläre Proteine in HIV-1 21
3.5 Zelluläre Chaperone 22
3.5.1 Peptidylproryl-cis/Zrans-Isomerasen 22
3.5.1.1 Cyclophiline 23
3.5.1.2 FKBPs und Parvuline 24
3.6 HIV-1 und Cyclophilin A 24
3.7 Zielsetzung 25
4 Material 27
4.1 Geräte 27
4.2 Chemikalien 28
4.3 Verbrauchsmaterialien 31
4.4 Bakterien 32
4.5 Zellinien 32
4.6 Leervektoren 32
4.7 Vpr-Konstrukte 33
4.8 Oligonukleotide 33
4.9 Antikörper 34
1 Inhaltsverzeichnis 1l
4.10Peptide 35
4.11 Polymerasen
4.12Restriktionsendonukleasen 35
4.13 Verdauungsenzyme
4.14 Molekulargewichtstandards 3
4.15 Inhibitoren 36
4.16 Puffer 37
4.17 Nährmedien 41
4.17.1 Bakterien 41
4.17.2 Kultivierung eukaryotischer Zellen 42
5 Metboden 43
5.1 Molekularbiologische Methoden 43
5.1.1 Agarosegelelektrophorese 43
5.1.2 Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 43
5.1.3 Nukleinsäurepräzipitation 43
5.1.4 Konzentrationsbestimmung 44
5.1.5 Spaltung von DNS durch Restriktionsendonukleasen 44
5.1.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) ^
5.1.7 Quantitative Plasmidisolierung 4
5.1.8 Herstellung kompetenter Bakterien 4*
5.1.9 Transformation 45
5.1.10 Anzucht und Lagerung von Bakterien 4
5.2 Methoden zur Arbeit mit RNS 46
5.2.1 Gewinnung des DNS-Templates für in vitro Transkription 46
5.2.2 In vitro Transkription 46
5.2.3 Isolierung von Gesamt-RNS aus Zellen 46
5.2.4 Northern-Blot-Analysen 47
5.2.5 Reverse Transkription 47
5.3 Proteinbiochemische Methoden 47
5.3.1 SDS-Polyacrylarnid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 47
5.3.2 Tris-Tricine-Gele 48
5.3.3 Coomassie-Färbung 48
5.3.4 Silbertarbung 48
5.3.5 Westem-Blot-Analysen 49
1 Inhaltsverzeichnis 3
5.3.6 PonceauS-Färbung 49
5.3.7 Immunpräzipitation 50
5.3.8 Chemische Quervernetzung (Crosslinking) 50
5.3.9 In vitro Translation 50
5.3.10In vivo [35S]-Markierungen 50
5.3.11 Subzelluläre Fraktionierung mittels Sucrosegradientenzentrifugation 51
5.3.12 Massenspektronomie 51
5.4 Zellbiologische Methoden 51
5.4.1 Auftauen von Zellen 51
5.4.2 Kultivierung von Adhäsionszellen 51
5.4.3 Kultivierung von Suspensionszellen 52
5.4.4 Kryokonservation 52
5.4.5 Transiente Transfektionen mit Lipofectamine 52
5.4.6 Transiente Transfektionen mit DMRIE-C 52
6 Ergebnisse 53
6.1 Biologische Relevanz der Interaktion von Cyclophilin A und Vpr 53
6.1.1 Zwischenzusammenfassung I 58
6.2 Ergänzende Untersuchungen zur Bedeutung von CypA auf die Vpr-Synthese 58
6.2.1 Untersuchungen in CypA-deletierten Zellen 58
6.2.2 Beteiligung weiterer Peptidylprolyl-cis/ r wis-Isomerasen an der Vpr- 59
Synthese
6.2.3 Beteiligung von Calcineurin an der Vpr-Synthese 62
6.2.4 Zwischenzusammenfassung II 63
6.3 Molekulare Charakterisierung der Rolle von CypA in der de novo Synthese 63
von Vpr
6.3.1 Untersuchungen zur Transkription von Vpr 63
6.3.2 Untersuchungen zur Translation von Vpr 64
6.3.2.1 Translationsstudien in vitro 64
6.3.2.2 Translationsstudien in vivo 66
6.3.2.3 Isolierung des Translationskomplexes von Vpr in vivo 69
6.3.3 Zwischenzusammenfassung III 70
6.3.4 Hinweise auf einen möglicherweise vorhandenen Translationsabbruch 70
6.3.5 Probenpräparation für die massenspektrometrische Analyse 74
6.3.6 Isolierung von Ribosomen-assoziiertem naszierenden Vpr 75
1 Inhaltsverzeichnis 1
6.3.7 Zwischenzusammenfassung IV 75
6.4 Untersuchungen zur Bedeutung der N-terminalen Proline für die Vpr-Synthese 76
6.4.1 Charakterisierung der Einzelmutanten 76
6.4.1.1 P5AMutante 76
6.4.1.2 PlOAMutante 77
6.4.1.3 P14AMutante 77
6.4.1.4 P35AMutante 78
6.4.1.5 P35NMutante 79
6.4.2 Charakterisierung der Kombinationsmutanten 80
6.4.2.1 P10/14A Mutante 80
6.4.2.2 P5/35A Mutante 80
6.4.2.3 P5/10/14A Mutante 81
6.4.2.4 P5/10/14/35A Mutante 82
6.4.3 Ergebnisübersicht der Mutationsanalysen 8^
6.4.4 Zwischenzusammenfassung V •
6.4.5 Untersuchungen zum Transkriptionsverhalten der Mutanten 4
6.4.6 In vitro Translationsstudien der Mutanten 8*
6.4.7 Zwischenzusammenfassung VI °
6.5 Ergebniszusammenfassung 87
7 Diskussion
7.1 Die Besonderheiten des N-Terminus von Vpr 89
7.2 Die Hemmung von CypA hat eine stark verminderte Vpr-Synthese zur Folge 90
7.3 Die Hemmung von CypA hat keinen Einfluss auf die Menge der vpr mRNS 92
7.4 CypA ist vermutlich bei einem co-translationalen Ereignis der Vpr-Synthese 92
beteiligt
7.4.1 Schützt CypA als Chaperon Vpr vor co-translationaler Degradation ? 95
7.4.2 Unterstützt CypA als PPIase die co-translationale Faltung von Vpr ? 97
7.5 Die biologische Relevanz der einzelnen Proline von Vpr 103
7.6 Mögliche neue Ansatzpunkte fiir antivirale Therapien 04
7.7 Schlusszusammenfassung und Ausblick 107
8 Abkürzungsverzeichnis 109
9 Literaturverzeichnis U2
10 Anhang 126
10.1 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen 126
1 Inhaltsverzeichnis 5
10.1.1 Vpr Nukleotid- und Aminosäuresequenz 126
10.1.2 CypA Nukleotid- und Aminosäuresequenz 126
10.2 Vektorkarten 128
10.2.1 pCMV2-Flag 128
10.2.2 pcDNA3 128
10.2.3 pEGFP-Nl 129
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