Etablierung und Charakterisierung eines In-vivo-RNA-Rekombinationssystems: mechanistische Studien und Erzeugung rekombinanter Pestiviren
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Wettenberg
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Inhaltsverzeichnis:
1. EINLEITUNG ~n
1.1 RNA-Rekombination 11
1.1.1 Definition und biologische Bedeutung der RNA-Rekombination 11
1.1.2 Putative Mechanismen der RNA-Rekombination 12
1.1.3 RNA-Rekombination beeinflussende Faktoren 1?
2 Pestiviren - ^0
1.2.1 Taxonomie. Morphologie, Genomaufbau und Biotypen 20
1.2.2 Wirtsspektrum von Pestiviren und Pathogenese von Pestivirus-induzierten Krankheiten 21
1.2.3 RNA-Rekombination bei Pestiviren 26
1.3 Zielsetzung der Arbeit 31
2. MATERIAL UND METHODEN 32
2.1 Material 32
2.1.1 Zellen 32
2.1.1.1 Eukaryonsche Zellen 32
2.1.1.2 Prokaryotische Zellen 32
2.1.2 Virusstämme 32
2.1.3 Plasmide und Gesamtklone 32
2.1.4 Antiseren und Antikörper 34
2.1.4.1 Antiseren 34
2.1.4.2 Antikörper 34
2.1.5 Synthetische DNA-Oügonukleonde 35
2.1.5.1 Oiigonukleotide für RT.PCR, gerichtete Mutation und Klonierung 35
2.1.5.2 CHigonukleonde für die DNA-Sequenzierung 40
2.1.6 Nährmedien 41
2.1.6.1 Zellkulturmedien 41
2.1.6.2 Bakterienkulturmedien 41
2.1.7 Lösungen und Puff er 42
2.1.8 Chemikalien 46
2.1.9 Radioaktiv markierte Substanz 48
2.1.10 Enzyme 48
2.1.11 Vorgefertigte Systeme ( Kits ) 48
2.1.12 Verbrauchsniaterialien 49
2.1.13 Geräte 50
2.2 Methoden „52
2.2.1 Zellkulturarbeiten 52
2.2.1.1 Allgemeine Zellkulturarbeiten 52
2.2.1.2 Bestimmung der Zellzahl 52
2.2.1.3 Virusinfektion von Zellen 53
2.2.1.4 Transfektion von Zellen mit synthetischer RNA 53
2.2.1.5 Piaquereinigung 54
2.2.1.6 Virustitration und Titerbestimmung 54
2.2.1.7 Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis von viralem Antigen 55
2.2.1.8 Serumneutralisationstest 55
2.2.1.9 Wachstumskurve 56
2.2.1.10 Kristallviolettfärbung von Zellen 57
-8-
Inhaltsverzeichnis
2.2.2 Mikrobiologische Methoden 57
2.2.2.1 Anzucht von Bakterien 57
2.2.2.2 Herstellung transformationskompetenter Bakterien 57
2.2.2.3 Transformation von kompetenten Bakterien mit Plasmid-DNA 58
2.2.2.4 Kleine Plasmidpräparation (Mini-Präp) 59
2.2.2.5 Große Plasmidpräparation (Midi-Präp) 60
2.2.3 Allgemeine Nukleinsäuretechniken 61
2.2.3.1 Phenol-/Chloroformremigung und Ethanoliallung 61
2.2.3.2 Photometrische Konzentratiombestimmung von Nukleinsäurelösungen 61
2.2.3.3 Agarosegelelektrophorese von Nukleinsäuren 62
2.2.4 RNA-Techniken 62
2.2.4.1 Synthetische Transkription 62
2.2.4.2 RNA-Isotienmg aus Zellen 63
2.2.4.3 RNA-Agarosegelelektrophorese für „Northern Blot 63
2.2.4.4 Transfer der RNA auf eine Nylonmembran („Northem Blot ) 64
2.2.4.5 RNA/DNA-Hybridisierung 64
2.2.4.6 Reverse Transkription (RT) 65
2.2.5 DNA-Techniken 65
2.2.5.1 Polymerasekettenreakn on (PCR) 65
2.2.5.2 Ortsgerichtete Mutagenese mittels „Quick Change (QC)-PCR 66
2.2.5.3 Radioaktive Markierung durch „Nick -Translation und Gelfiltration einer cDNA-Gensonde 67
2.2.5.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 67
2.2.5.5 Enzymarische Spaltung von DNA 68
2.2.5.5.1 cDNA-Linearisierung für die synthetische Transkription 68
2.2.5.5.2 DNasel-Verdau 68
2.2.5.5.3 Dpnl-Verdau von QC-PCR-Produkten 68
2.2.5.6 Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-DNA-Ligase 68
2.2.5.7 Sequenzierung von DNA 69
2.2.5.8 DNA-Elektrophorese in denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen 70
2.2.5.9 Konstruktion der cDNA-Klone 71
2.2.5.9.1 p+ubiSGT 71
2.2.5.9.2 p-ubiSGT 71
2.2.5.9.3 p-CP7-5A 72
2.2.5.9.4 pNCP7-Ml 72
2.2.5.9.5 p+ubi SGT-M1M2 72
2.2.5.9.6 p+ubi SGT-M2M3 73
2.2.5.9.7 pNCP7-ffmdIILWi rfIII 73
2.2.5.9.8 pNCP7-GAA 73
2.2.5.9.9 pNCPJ-bNaeVSmal 74
2.2.5.9.10 pNCP7-ACM/C7aI 74
2.2.5.9.11 pCP7-11449 74
2.2.5.9.12 pCP7-11284 74
2.2.5.9.13 p+SGT-CP7-11201 75
2.2.5.9.14 p+SGT-CP7-11450 75
2.2.5.9.15 p+ubi-Alfort 76
2.2.6 Proteinanalytische Methoden 77
2.2.6.1 Zelllyse 77
2.2.6.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 77
2.2.6.3 Immunoblotanalyse nach Proteintransfer auf eine Nitrozellulosemembran 78
2.2.7 Analyse von Sequenzdaten 78
-9-
Inhaltsverzeichnis
3 ERGEBNISSE 80
3.1 Entwicklung und Charakterisierung eines in vivo RNA-Rekombinanonssystems für BVDV 80
3.1.1 Etablienmg eines RNA-Rekombinationssystems für BVDV 80
3.1.2 Einfluss der in den synthetischen Transkriptionsansätzen enthaltenen cDNA auf die Entstehung eines
zytopathischen Effekts in Zellknltur 82
3.1.3 Korrelation zwischen den Mengen an transfizierter +ubi SGT-RNA und der Anzahl voneinander
unabhängig entstandener ZPEs in Zellkultur 84
3.1.4 Charakterisierung von zp BVDV-Rekombinanten 85
3.2 Mechanistische Studien zur RNA-Rekombination 91
3.2.1 Einfluss der Polarität des synthetischen Transkripts +ubi SGT 91
3.2.2 Untersuchungen zur Replikan onsinitianon des Minusstrangs von zp BVDV CP7-5A 92
3.2.3 Stabilität von+ubi SGT nach Transfektion 94
3.2.4 RNA-Rekombination nach Kotransfeknon von zwei synthetischen RNAs in nicht infizierte Zellen 95
3.2.5 RNA-Rekombinanon nach Kotransfektion von zwei replikab onsinkompetenten RNAs 96
3.2.6 Charakterisierung von nzp BVDV-Rekombinanten 97
3.2.7 Ursprung der viralen3 NTR in rekombinanten BVDV-Genomen 100
3.2.8 Kotransfekn onen von +ubi SGT mit RdRp-Mutanten von NCP7-5A 101
3.2.9 RNA-Rekombination in vivo in Abwesenheit einer funktionellen pestiviralen RdRp 104
33 Gezielte Anwendung des Rekombinationssystems:...
Erzeugung und Charakterisierung eines von einem Helfervirus unabhängigen zp KSPV ... .............. 111
3.3.1 Etablierung eines in vivo RNA-Rekombinationssystems für KSPV 111
3.3.2 Biologische Klonterung und Genomanalyse des rekombinanten zp KSPV CP Gl 113
3.3.3 Eigenschaften von CPG1 auf verschiedenen Zelllinien 116
3.3.4 Wachstumskinetik von CP Gl 118
3.3.5 NS3-Expression von CPG1 118
3.3.6 Eignung von CP Gl für Serumneutralisationstests 120
3.3.7 Genetische Stabilität von CPG1 122
4. DISKUSSION 128
4.1 Entwicklung und Charakterisierung eines in vivo RNA-Rekombinationssystems für BVDV. 128
4.2 Mechanistische Studien zur RNA-Rekombination in vivo 132
43 Gezielte Anwendung des Rekombinationssystems: —.
Erzeugung und Charakterisierung eines von einem Helfervirus unabhängigen zp KSPV 142
5. ZUSAMMENFASSUNG 148
6. SUMMARY 151
7. LITERATURVERZEICHNIS 153
8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 168
9. PUBLIKATIONEN, VORTRÄGE UND POSTER._ 170
10. DANKSAGUNG 171
-10-
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