Entwicklung und Charakterisierung nanopartikulärer Trägersysteme für Nukleinsäuren zum Einsatz in der Gentherapie:
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| Format: | Thesis Book |
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| Published: |
Aachen
Shaker
2003
|
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
2 THEORETISCHER TEIL 3
2.1 Gentherapie 3
2.1.1 Verabreichung von DNA zu Gentherapiezwecken 5
2.1.2 Darreichungssysteme 6
2.1.2.1 Virale Vektoren 7
2.1.2.2 Nicht-virale Vektoren 9
2.1.3 Therapeutischer Einsatz 19
2.1.4 DNA-Vakzine 20
2.1.4.1 Trägersysteme für DNA-Vakzine 22
2.1.5 Sicherheit, ethische Aspekte und Aussichten 23
2.2 Nanopartikel 26
2.2.1 Definition 26
2.2.2 Ausgangsmaterialien für Nanopartikel 26
2.2.3 DNA-Bindung an Nanopartikel 27
2.2.4 Zielgerichtete Verabreichung DNA-haltiger Nanopartikelsysteme 30
3 MATERIAL UND METHODEN 33
3.1 Material 33
3.1.1 Laborgeräte 33
3.1.2 Materialien 34
3.1.3 Reagenzien, Puffer, Lösungen und Zellkulturmedien 34
3.1.3.1 Plasmid-Präparation 34
3.1.3.2 Nanopartikelherstellung 35
3.1.3.3 Nanopartikelcharakterisierung 36
3.1.3.4 Zellkulturen 38
3.1.3.4.1 Zellen 38
3.2 Methoden.40
3.2.1 Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli-Stämmen 40
3.2.1.1 Transformation 40
3.2.1.2 Bakterienkultur 41
3.2.1.3 Plasmid Präparation 41
3.2.1.4 Verdau des Plasmids mit BamHI 42
I
Inhaltsverzeichnis
3.2.1.5 Überprüfen der Funktionalität des Plasmides 43
3.2.2 Herstellungsmethoden für Nanopartikel 43
3.2.2.1 Kationische Nanopartikel 43
3.2.2.1.1 DEAE-Dextran-stabüisierte Polyhexylcyanoacrjdat-Nanopartikel (PHCA NP) 43
3.2.2.1.2 MethodeA: Herstellung positiver HSA NP durch Desolvatatum mit Ethanol und
anschließender Umsetzung mit Cholamin (HSA-Chol NP) oder Cystamin (HSA-
CysNP) 44
3.2.2.1.3 Methode B: Herstellung durch Desolvatation kanonisierter HSA-Lösung mit
Natriumsulfat-Lösung unter Einbindung des Plasmides in die Matrix 45
3.2.2.2 HSA-Poly-L-Lysin-Nanopartikel(HSA-PLLNP) 45
3.2.2.3 Chitosan-Nanopartikel 45
3.2.2.4 Gelatine-Polyethylenimin (PEI)-Nanopartikel (Gel-PEI NP) 46
3.2.2.5 HSA-PEI Nanopartikel (HSA-PEINP) 47
3.2.2.6 PEI-DNA Kondensate 48
3.2.2.7 Gecoatete Komplexe 48
3.2.2.8 Einbindung von Oligonukleotiden in die Matrix von HSA-PEI NP 49
3.2.2.8.1 Gelelektophorese 49
3.2.3 Charakterisierung der Nanopartikel 50
3.2.3.1 Bestimmung des Nanopartikelgehaltes 50
3.2.3.2 Quantifizierung der DNA Einbindung mittels PicoGreen®Assay 50
3.2.3.3 Bestimmung des Anteils an gelöstem, nicht desolvatisierten Protein 51
3.2.3.4 Schutz vor enzymatischem Abbau 51
3.2.3.5 Indirekte Bestimmung von Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche 51
3.2.3.6 Etablierung eines Saccharose-Gradienten zur Aufreinigung von Gelatine-bzw.
HSA Nanopartikeln von nicht desolvatisiertem Protein 52
3.2.3.7 Bestimmung der Partikelgröße am Photonenkorrelationsspektrometer 54
3.2.3.8 Bestimmung des Zetapotentials 54
3.2.3.9 Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy) 54
3.2.4 Oberflächenmodifikation der NP 56
3.2.4.1 Einführung von SH-Gruppen mit Trauts Reagens 56
3.2.4.2 Bindung von Transferrin 57
3.2.4.2.1 Transferrin-Bindung mittels EDC 57
3.2.4.2.2 Transferrin-Bindung mittels Sutfo-MBS 57
3.2.4.3 Bindung von einem Antikörper (anti-CD3) 57
3.2.4.3.1 Bindung von anti-CD3 mittels Sulfo-MBS 57
3.2.5 ZeUkulturen: 58
3.2.5.1 293,293T, HeLa 58
3.2.5.2 M0/MAK.DC 59
Inhaltsverzeichnis
3.2.5.2.1 Isolierung von PBMC 59
3.2.5.2.2 Monocyten/Makrophagen 59
3.2.5.2.3 Dendritische Zellen (DC) 60
3.2.5.2.4 M-CSF Makrophagen 60
3.2.5.3 CEM,Jurkat 60
3.2.6 Cytotoxizitäts-Test (MTT Test) 60
3.2.7 Zellaufhahmestudien 61
3.2.7.1 Konfokales Laserscanning Mikroskop (Confocal Laser Scanning Microscope
CLSM) 61
3.2.7.2 Fluoreszenzmarkienmg der DNA 62
3.2.7.3 Inkubation und Fluoreszenzmarkieren der Zellmembran von 62
3.2.7.3.1 adhärenten Zellen (Monocyten/Makrophagen) 62
3.2.7.3.2 subadhärentenbzw. Suspensionszellen (293, DC) 63
3.2.8 Transfektionsstudien 64
3.2.8.1 Transfektion mit Nanopartikeln 64
3.2.8.1.1 Transfektion von primären Zellen des Mononukleären Phagozytensystems 64
3.2.8.1.2 Transfektion von Zelllinien (293, HeLa) 65
3.2.8.1.3 Transfektion von lymphocytären Zelllinien (CEM,Jurkat) 65
3.2.8.2 Andere Transfektionsmethoden: CaPi, DOTAP®, Lipofectamine®, Superfect® und
Effectene® 65
3.2.9 Nachweis der Genexpression 67
3.2.9.1 Fluoreszenzmikroskop 67
3.2.9.2 X-Gal-Färbung 67
3.2.9.3 Luciferase Assay 67
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 69
4.1 Überprüfen der Funktionalität der Plasmide durch klassische Transfektion (Calcinm-
Präzipation 69
4.2 Kationische Nanopartikel mit gebundener DNA . 70
4.2.1 DNA-beladene DEAE-Dextran PHCA Nanopartikel (PHCA NP) 70
4.2.2 Kationische Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA) 72
4 1 PvtntnTiTitSt Aer katinnfarhen NP 76
4.3.1 Zellviabüität von 293-Zellen 76
4.3.2 Zellviabüität von Makrophagen 79
4.4 HSA-Poly-L-Lysiii Nanopartikel (HSA-PLL NP) 81
4.4.1 DNA-Einbindung in HSA-PLL NP 82
m
Inhaltsverzeichnis
4.4.2 Protein-Einbindung in HSA-PLLNP 83
4.5 Chitosan Nanopartikel 84
4.5.1 Expression in Zellkultur 84
4.5.2 Cytotoxizität 87
4.5.3 Zellau ahmestudien mit Chitosan NP 89
4.6 Gtlatinc-PEI NP 93
4.6.1 DNA-Einbindung in Gelatine-PEI Nanopartikel (Gel-PEI NP) 94
4.6.2 DNA-Einbindung in Gel-PEI NP 95
4.6.3 Gel-PEINP ohne Giadienten-Aufreinigung, Transfektion in Zellkultur 95
4.6.4 Gel-PEINP: Aufreinigung über Saccharosegradient 96
4.6.5 Bindung von Transferrin (Tf) über EDC an Gel-PEI NP 98
4.6.6 Ca2+-Inkubation 99
4.7 HSA-PEI Nanopartikel (HSA-PEI NP) 100
4.7.1 Physikalische Parameter der HSA-PEI NP 101
4.7.1.1 Größe und Zetapotential 101
4.7.1.2 Zetapotential bei verschiedenen pH-Werten 102
4.7.2 Oberflächenstruktur der HSA-PEI NP 104
4.7.3 DNA-Einbindung in HSA-PEI NP (Gel Retardation Assay) 104
4.7.4 DNA-Einbindung in HSA-PEI NP 105
4.7.5 Schutz vor enzymatischem Abbau 106
4.7.6 Indirekte Bestimmung der Carboxylgrappen 107
4.7.7 Quantifizierung der Expression mittels Luciferase Assay 107
4.7.8 Expression in Abhängigkeit des N/P Verhältnisses 108
4.7.9 Vergleich mit kommerziellen Transfektionsreagenzien 109
4.7.10 Cytotoxizität 110
4.7.11 Kinetik der Expression 111
4.7.12 Transferrin-Kopplung an HSA-PEI NP 113
4.7.12.1 Transferrin-Kopplung durch Carbodiimid-Reaktion (EDC) 113
4.7.12.2 Transferrin-Kopplung durch Sulfo-MBS 116
4.7.13 Antikörper-Kopplung 116
4.7.14 Lagerstabilität 118
4.7.15 Funktionalität in Zellkultur nach Gefriertrocknung 119
4* PEI-DNA-Komplcu 120
4.8.1 Genexpression in Abhängikeit des N/P-Verhältnisses 121
4.8.2 Cytotoxizität von PEI-DNA Komplexen 122
Inhaltsverzeichnis
4.9 Gecoatete Komplexe mit HSA 123
4.10 Einbindung von Oligonnkleotiden 125
4.11 Scblossfolgerung 127
5 ZUSAMMENFASSUNG 129
5.1 Kanonische Nanopartikel mit adsorbierter DNA 130
5.2 Proteinbasierte Nanopartikel mit inkorporierter DNA 130
5.2.1 DNA-haltige Nanopartikel aus Gelatine und Polyethylenimin (Gel-PEI NP) 130
5.2.2 DNA-haltige Nanopartikel aus humanem Serumalbumin und Polyethylenimin (HSA-
PEINP) 131
6 LITERATUR 133
7 LEBENSLAUF 145
V
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