Untersuchungen zu Signalwegen von Sphingosin-1-phosphat und Lysophosphatidsäure und deren Einfluss auf die Proliferation und Migration:
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Berlin
Weißensee-Verl.
2003
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| Series: | Berliner Beiträge zur Pharmazie
5 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I EINFÜHRUNG 1
1 Lysophospholipide (LPL) 3
1.1 Biosynthese und Metabolismus von S1P 6
1.2 Biosynthese und Metabolismus von LPA 9
2 LPL-Rezeptoren 11
2.1 S1 P-Rezeptoren 13
2.2 LPA-Rezeptoren 14
3 Transformierender Wachstumsfaktor-ß (TGF-ß) 16
3.1 Bedeutung der TGF-ß-Familie 16
3.2 TGF-ß-Rezeptoren 19
3.3 Smad-Proteine und ihre Inhibierung 20
4 Wündheilung 23
5 Zielsetzung und Fragestellung 29
II MATERIAL UND METHODEN 31
1 Material 33
1.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 33
1.2 Zellkultur-Medien und Lösungen 36
1.2.1 Keratinozyten Wachstumsmedium (KGM) 36
1.2.2 Fibroblasten Wfechstumsmedium (FGM) 36
1.2.3 Melanozyten Wachstumsmedium (MGM) 36
1.2.4 Transportmedium 37
1.2.5 Antibiotika-Lösung 37
1.2.6 PBS-Lösung— 37
1.3 Oligonukteotide — 37
1.4 Geräte ¦¦ ¦¦ 39
V
Inhaltsverzeichnis
2 Methoden 41
2.1 Isolierung und Kultivierung der Zellen 41
2.1.1 Keratinozylen 41
2.1.2 Fibroblasten 42
2.1.3 Passagierung 42
2.1.4 Jurkat-Zellen —— 43
2.2 Zubereitung der Testsubstanzen • 43
2.3 Bestimmung der Sphingosin-Kinase-Aktivität 44
2.4 Bestimmung der Apoptoserate 44
2.5 [3H]-Thymidin-Einbau 45
2.6 Proteinbestimmung——— 46
2.7 Bestimmung der PKC-Aktivität 46
2.8 Isolierung und Reinigung von mRNA 47
2.9 Amplrfizierung von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 49
2.9.1 Synthese einzelsträngiger cDNA für die PCR 49
2.9.2 Amplifizierung von DNA mittels PCR 49
2.10 GDP/GTP Austausch 50
2.11 Transfektion der Sphingosin-Kinase 51
2.11.1 Transformation und Expression in E. coli 51
2.11.2 Transfektion des Plasmids 52
2.11.3 Bestimmung der Transfektionseffizienz 53
2.12 Mikroinjektion -53
2.13 Migrationsassay 54
III ERGEBNISSE .55
1 Sphingosin-1-phosphat (S1P) -57
11 Einfluss von S1P auf die Apoptose in humanen Keratinozyten 57
Inhaltsverzeichnis
1.1.1 Bedeutung von S1P bei 1 x,25(OH)2VD3-vermittelten Effekten in
Keratinozyten 57
1.1.2 DMS inhibiert die Sphingosin-Kinase nicht über die PKC 60
1.2 Einfluss von S1P auf das Zellwachstum humaner Keratinozyten und
Fibroblasten 63
1.3 S1 P-Rezeptoren 66
1.3.1 Expression von S1 P-Rezeptoren in humanen Hautzellen 66
1.3.2 Funktionelle Charakterisierung der S1 P-Rezeptoren 68
1.4 Transfektion der Sphingosin-Kinase 70
1.5 Mikroinjektion von S1P in Keratinozyten 73
1.6 S1P und Migration 75
1.6.1 Einfluss von S1P auf die Migration von Keratinozyten 75
1.6.2 Einfluss von S1Pi- und S1P3-Antisense ODN auf die S1P-induzierte
Migration humaner Keratinozyten 78
1.7 Untersuchungen zu intrazellulären Signalwegen von S1P in humanen
Keratinozyten und Fibroblasten 80
1.7.1 Einfluss von Smad2/3 Antisense-ODN auf das Wachstum von
Keratinozyten und Fibroblasten 80
1.7.2 Einfluss von Smad2/3 Antisense-ODN auf die Migration von
Keratinozyten 82
1.7.3 Untersuchungen zu der TGF-ß-vermittelten Migration mit S1Pi-
Antisense-ODN 84
1.7.4 Bedeutung von TGF-ß bei der S1 P-induzierten Migration 85
2 Lysophosphatidsäure (LPA) 87
2.1 Untersuchungen zum Einfluss von LPA auf die Proliferation humaner
Keratinozyten und Fibroblasten 87
2.2 Expression der LPA Rezeptoren 91
2.3 Einfluss von LPA auf die Migration von humanen Keratinozyten 93
Inhaltsverzeichnis
2.4 Untersuchungen zu intrazellulären Signalwegen von LPA in humanen
Keratinozyten und Fibroblasten 95
2.4.1 Einfluss von Smad2/3 Antisense ODN auf die LPA induzierte
Proliferationshemmung 95
2.4.2 Einfluss von Smad2/3-Antisense-ODN auf die LPA-induzierte Migration
humaner Keratinozyten 96
IV DISKUSSION 99
1 Sphingosin-1 -phosphat 101
1.1 Signalwege von S1P 101
1.1.1 S1 P-Rezeptoren 103
1.1.2 Intrazelluläre Wirkungen von S1P 105
1.2 Bedeutung von S1P in dermalen und epidermalen Zellen -107
1.2.1 Einfluss von S1P auf die Apoptose -107
1.2.2 Einfluss von S1P auf die Migration 110
1.2.3 Einfluss von S1P auf das Zellwachstum ¦ 111
1.2.4 Einfluss von S1P auf die Wundheilung -113
2 Lysophosphatidsäure 115
2.1 Signalwege von LPA 115
2.1.1 LPA-Rezeptoren 115
2.1.2 Intrazelluläre Wirkungen von LPA —115
2.2 Bedeutung von LPA in dermalen und epidermalen Zellen 117
2.2.1 Einfluss von LPA auf die Migration — 117
2.2.2 Einfluss von LPA auf das Zellwachstum 118
2.2.3 Einfluss von LPA auf die Wundheilung 119
3 Ausblick — 121
V ZUSAMMENFASSUNG — -123
VI LITERATURVERZEICHNIS—— 129
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