Veränderte Expression von Ionentransportsystemen bei Hypertonie: Quantifizierung von Ionentransportsystemen unter besonderer Betrachtung der Isoformen der Na + K + -ATPase im menschlichen Herzgewebe mittels Polymerase-Ketten-Reaktions-Technik
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| Language: | German |
| Published: |
Wettenberg
VVB Laufersweiler
1999
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| Edition: | 1. Aufl. |
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VI
Tabellenverzeichnis IX
Abbildungsverzeichnis X
1 Einleitung und Problemstellung 1
1.1 Hypertonie 1
1.2 lonentransportsysteme und ihre Wirkung im Zellmetabolismus 6
1.2.1 Primäraktive Na+-und Ca2*-Ionentransporter 6
1.2.2 Sekundäraktive Na*- und Ca2+-Ionentransporter 15
1.2.3 Ionenkanäle 19
1.3 Problemstellung 27
2 Material und Methoden 28
2.1 Material 28
2.1.1 Geräte 28
2.1.2 Chemikalien 29
2.1.3 Lösungen 31
2.1.4 Probenmaterial 32
2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden 34
2.2.1 Behandlung von Geräten und Lösungen 34
2.2.2 Gelelektrophoresen für Nukleinsäuren 34
2.2.2.1 Agarose-Gelelektrophorese 34
2.2.2.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 35
2.2.3 Anfärbung von Nukleinsäuren in Gelen mit Ethidiumbromid 35
2.2.4 Autoradiographie von Nukleinsäuren in Gelen 36
2.2.5 RNA-Isolierung mittels Micro RNA Isolation Kit (Stratagene) 36
2.2.5.1 Genomische DNA als Verunreinigung bei der RNA-Isolation 38
IV Inhaltsverzeichnis
2.2.5.2 Konzentrationsbestimmung mittels Spektralphotometrie 39
2.2.5.3 Qualitätsüberprüfung der RNA mittels Formaldehyd-Agarose-Gel 40
2.2.6 DNA-Erststrangsynthese 41
2.2.7 PCR (Polymerase-Chain-Reaction) 43
2.2.7.1 Oligonukleotidprimer 44
2.2.7.2 Kalkulation der Annealingtemperaturen 46
2.2.7.3 Quantitative PCR 47
2.2.7.4 Qualitätskontrolle der PCR 49
2.2.8 Phosphorimager-Technik zur Quantifizierung der Amplifikationsprodukte 49
2.2.9 Restriktionsanalyse zum Nachweis von Mutationen 54
2.3 Biochemische Arbeitsmethoden 55
2.3.1 Isolation der Zellmembranen
2.3.2 Proteinbestimmung nach Bio-Rad 55
2.3.3 Bestimmung der Ouabainbindung 56
2.4 Methoden der Auswertung 58
2.4.1 Computermethoden 58
2.4.2 Statistische Auswertung 58
3 Ergebnisse S9
3.1 Optimierung der Bedingungen für die quantitative PCR mittels YEPa2 59
3.2 Ergebnisse der Vorversuche * 2
3.3 Ergebnisse der Untersuchungen an Gewebe von normet, und hypert. Patienten 65
3.3.1 RNA-Isolierung aus Gewebe des rechten Herzohrs und Erststrangsynthese 65
3.3.2 Ergebnisse der Untersuchung der Ionentransportsysteme 66
3.3.2.1 NaVK*-ATPase 66
3.3.2.1.1 Quantifizierung der Ausgangsmengen der PCR-Amplifikate 68
3.3.2.1.2 Messung der Ouabainbindung 70
3.3.2.2 Na*/Ca2*-Austauscher 72
3.3.2.3 Na /rT-Austauscher 73
3.3.2.4 Natriumkanäle 74
Inhaltsverzeichnis V
3.3.2.5 Caw-ATPasen 75
3.3.2.5.1 SarkoendoplasmatischeCa2*-ATPase 75
3.3.2.5.2 Plasmamembranständige Ca2+-ATPasen 76
3.3.2.6 Kalziumkanäle 77
3.3.3 Ergebnisse der Untersuchung der schweren Myosinketten 78
4 Diskussion 81
5 Zusammenfassung 102
6 Literaturverzeichnis 103
7 Anhang 119
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