Bedeutung von Rho-Proteinen für die Endotoxin-induzierte Interleukin-8-Synthese in humanen Endothelzellen:
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Göttingen
Cuvillier
2001
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis I_
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen 1
1 Einführung 5
1.1 Adult Respiratory Distress Syndrome 5
1.2 Interleukin-8 8
1J Endotoxin-induzierte Signaltransduktion 9
1.3.1 Rezeptoren 9
1.3.2 NF-kB 10
1.3.3 Tyrosinkinasen 10
1.3.4 Proteinkinase C 11
1.3.5 Zyklische Nukleotide 12
1.4 Rho-Proteine 13
1.4.1 Allgemeines 13
1.4.2 Funktionszyklus der Rho-Proteine 14
1.4.3 Zytoskelett 17
1.4.4 Modifikation der Rho-Funktion und des Zytoskeletts 18
1.5 Aufgabenstellung 20
2 Material 21
2.1 Chemische und biologische Substanzen 21
2.2 Medien und Pufferlösungen 25
2.2.1 Zellkulturbedarf 25
2.2.2 Herstelluno von retinalem Wachstumsfaktor (RDGF) für HUVECs-Medium: 26
2.2.3 Losungen für Northern Blot 27
2.2.4 losungen für luziferase-assay 28
2.2.5 LOSUNGEN FÜR EMSA 29
2.2.6 Lösungen für die F-Aktin-Bestimmung 31
2.2.7 Lösungen für die G-Aktin-Bestimmung 32
2 J Zubehör und Geräte 33
2.3.1 Zellkulturbedarf 33
2.3.2 Northern Blot 34
2.3.3 Luziferase-Assay 34
2.3.4 EMSA 34
2.3.5 f-aktin-bestimmuno 35
2.3.6 G-Aktin-Bestimmung 35
2.3.7 Morphologische Untersuchungen 35
3 Methoden 37
3.1 Isolation und Kultivierung von Endothelzellen 37
3.1.1 Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (HUVECs) 37
3.1.2 Pulmonalarterielle Endothelzellen 38
3.2 Bestimmung des Interleukin-8 38
3.2.1 stimulations-undlnhibmonsversuche 38
3.2.2 Vektorielle Sekretion 39
II Inhaltsverzeichnis
3.3 Northern-Blot 40
3.3.1 Prinzip 40
3.3.2 Radioaktives Markieren der cDNA 40
3.3.3 Isolation der RNA 40
3.3.4 RNA-Gelelektrophorese 41
3.3.5 RNA-Transfer auf Nylon-Membranen 41
3.3.6 hybridisierung 41
3.3.7 autoradiographie 42
3.4 Reportergenversuche zur Messung der NF- B-Aktivierung 42
3.4.1 Prinzip 42
3.4.2 Transiente Transfektion von HUVECs 42
3.4.3 Messung der Luziferase-Aktivität 43
3.5 Gel-Retentionsanalyse 43
3.5.1 Prinzip 43
3.5.2 Markieren des NF-kB-Konsensus-Oligonukleotids 44
3.5.3 Vorbereitung 44
3.5.4 Extraktion der Kernproteine 44
3.5.5 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 45
3.6 Bestimmung des endothelialen F-Aktin 45
3.6.1 Grundlagen 45
3.6.2 Probenaufbereitung 45
3.6.3 Messung 46
3.7 Bestimmung des endothelialen G-Aktin 46
3.7.1 Grundlagen 46
3.7.2 Probenaufbereitung 46
3.7.3 Messung 47
3.8 Proteinbestimmung 47
3.9 LDH-Bestimmung 47
3.10 Phasenkontrastmikroskopische Untersuchungen 48
3.11 Statistische Auswertung 48
4 Ergebnisse 49
4.1 Charakterisierung der LPS-induzierte IL-8-Synthese 49
4.1.1 Stimulation durch Endotoxin und TuMORNEKROSEFAKTOR-a 49
4.1.2 Parakrine Modulation der LPS-induzierten IL-8-Synthese 49
4.1.3 Inhibition durch Steroide 53
4.1.4 Vektorielle Sekretion 53
4.2 Signaltransduktion der LPS-induzierten II-8-Synthese 56
4.2.1 Effekt von Lovastatin 56
4.2.2 Effekt voNC£OS7W/J/(Wi « «cvi£ToxiNB(TCDB-10463) 59
4.2.2.1 Effekt von TcdB-10463 auf die Interleukin-8-Freisetzung 59
4.2.2.2 Effekt von TcdB-10463 und Lovastatin auf das Zytoskelett 62
4.2.2.3 Einfluss Aktin-stabilisierender und -destabilisierender Toxine 83
4.2.2.4 Einfluß des TcdB-10463 auf Sekretion und Synthese des Interleukin-8 83
4.2.2.5 Einfluß des TcdB-10463 auf die NF-KB-Aktivierung 87
4.2.3 Bedeutung von Tyrosinkinasen 90
4.2.4 bedeutung der pkc 90
4.2.5 bedeutung zyklischer nukleotide 94
Inhaltsverzeichnis III_
5 Diskussion 97
5.1 Charakterisierung der Endotoxin-induzierten IL-8-Synthese 97
5.1.1 Transkription und posttranskriptionelle Regulation 98
5.1.2 Parakrine Modulation der Interleukin-8-Synthese 99
5.1.3 Inhibition duch Glukokortikoide 100
5.1.4 Vektorielle Sekretion 101
5.2 Signaltransduktion 102
5.2.1 Effekt von Lovastatin 102
5.2.2 EffektvonTcdB-10463 102
5.2.3 Zytoskelett ale Effekte von TcdB-10463 und Lov ast atin 103
5.2.3.1 TcdB-10463 103
5.2.3.2 Lovastatin 105
5.2.4 Sequentielle versus parallele Regulation Rho-vermittelter Effekte 107
5.2.4.1 Bedeutung zytoskelettaler Veränderungen für die IL-8-lnhibition 107
5.2.4.2 TcdB-10463 verhindert transkriptioneile Aktivierung des IL-8-Gens 109
5.2.5 Effekt von Tyrosinkinase-Antagonisten 110
5.2.6 Bedeutung der Proteinkinase C 111
5.2.7 Effekt zyklischer Nukleotide 112
5.2.8 Synopsis 112
53 Therapeutische Ausblicke 114
6 Zusammenfassung 115
7 Literatur 117
Danksagung 161
Eidesstattliche Erklärung 163
Lebenslauf 165
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