Untersuchungen zur Funktion der Basalmembranproteine Nidogen-1 und Nidogen-2 in der Haut:
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|---|---|
| adam_text | 1 Einleitung 1
1.1 Die extrazelluläre Matrix 1
1.2 Die Basalmembran 1
1.2.1 Kollagen IV 3
1.2.2 Perlecan 4
1.2.3 Laminin 5
1.2.4 Nidogen 7
1.2.4.1 Nidogen-1 7
1.2.4.2 Nidogen-2 9
1.2.4.3 Mausmodelle mit Nidogen-Defizienz 11
1.2.5 Der Laminin-Nidogen-Komplex 12
1.3 Zellrezeptoren für Basalmembrankomponenten 14
1.4 Aufbau und Funktionen der Haut 17
1.4.1 Entwicklungsstadien der Haut 18
1.4.2 Die dermo-epidermale Basalmembranzone 19
1.5 Ziel dieser Arbeit 21
2 Material und Methoden 23
2.1 Material 23
2.1.1 Synthetische Oligonukleotide 23
2.1.2 Antikörper 23
2.2 Häufig verwendete Puffer und Ansätze 26
2.3 Methoden 26
2.3.1 Versuchstierhaltung 26
2.3.2 Genotypisierungen 27
2.3.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanzbiopsien 27
2.3.2.2 Southern Blot Analyse (Southern, 1975) 27
2.3.2.3 Analyse der genomischen DNA für Nidogen-1 mit Hilfe der Polymerase-
Kettenreaktion 29
2.3.3 Isolierung von Korneozyten 29
2.3.4 Barrierefunktionstest mittels Toluidinblau-Färbung 29
2.3.5 Proteinchemische Analysen 30
2.3.5.1 Proteinextraktion 30
2.3.5.2 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA 30
2.3.5.3 Western Blot 30
2.3.6 Herstellung von Hautschnitten für histologische Färbungen und Immun¬
färbungen 31
2.3.6.1 Vorbereitung der Schnitte für histologische Färbungen und Inkubation
mit Antikörpern 32
2.3.6.1.1 Histologische Färbungen 32
2.3.6.1.2 Indirekte Immunfluoreszenz 34
2.3.6.1.3 Nachweis proliferierender Zellen in Hautschnitten 34
2.3.6.1.4 Nachweis apoptotischer Zellen in Hautschnitten 35
2.3.7 Elektronenmikroskopische Analysen 35
2.3.8 Wundheilung 35
2.3.8.1 Setzen der Wunden 35
2.3.8.2 Gewinnung und Aufarbeitung der Wunden 36
2.3.8.3 Festlegen der Wundmitte 36
2.3.9 Behandlung von Tieren mit Crotonöl 37
2.3.9.1 Behandlung der Tiere 37
2.3.9.2 Gewinnung und Aufarbeitung der Proben 37
2.3.10 Tumorzellinvasion und Metastasierung 38
2.3.10.1 Zellkultivierung 38
Inhalt
2.3.10.2 Tumorzellinjektion 38
2.3.10.3 Gewinnung und Aufarbeitung der Proben 38
2.3.11 Mikroskopie 39
2.4 Statistische Auswertung und Darstellung der Ergebnisse 39
3 Ergebnisse 40
3.1 Zucht und Genotypisierung der Nidogen defizienten Tiere 40
3.1.1 Zucht der verschiedenen Nidogen defizienten Mäuse 40
3.1.2 Analyse der genomischen DNA zur Genotypisierung der Mäuse 41
3.1.3 Analyse des Phänotyps der Nidogen defizienten Mäuse 43
3.2 Analyse der Haut von Nidogen defizienten Tieren 44
3.2.1 Histologische Analyse 45
3.2.2 Analyse des epidermalen Differenzierung 47
3.2.3 Nachweis proliferativer und aopototischer Zellen in Hautschnitten
Nidogen defizienter Tiere 50
3.2.4 Untersuchung der Barrierefunktion der Haut 52
3.2.5 Aufbau und Zusammensetzung der dermo-epidermalen
Basalmembranzone 54
3.2.5.1 Nachweis verschiedener Basalmembrankomponenten 54
3.2.5.2 Analyse von Verankerungsstrukturelementen der dermo-epidermalen
Junktionszone mittels indirekter Immunfluoreszenz und Western Blot
Analyse 55
3.2.6 Ultrastruktur der dermo-epidermalen Basalmembran 60
3.2.7 Untersuchung der Blutgefäße in der Haut 61
3.3 Provokationsexperimente mit Nidogen-1 defizienten Tieren 65
3.3.1 Wundheilung 66
3.3.1.1 Makroskopische Beurteilung des Verlaufs der Wundheilung 67
3.3.1.2 Mikroskopische Analyse der Wunden 68
3.3.1.2.1 Histologische Beurteilung der Wunden 69
3.3.1.2.2 Epidermale Differenzierung nach erfolgter Reepithelialisierung 71
3.3.1.2.3 Proliferation und Apoptose 73
3.3.1.2.4 Aufbau der Basalmembranen 75
3.3.1.2.5 Auf-und Abbau des Granulationsgewebes 79
3.3.2 Unspezifische Irritation 81
3.3.2.1 Makroskopische Untersuchungen der Ohren nach der Behandlung mit
Crotonöl 82
3.3.2.2 Mikroskopische Analysen der Ohren nach der Behandlung mit Crotonöl 83
3.3.2.2.1 Histologie der mit Crotonöl behandelten Ohren 83
3.3.2.2.2 Analyse der Proliferation 84
3.3.2.2.3 Analyse von Differenzierungsmarkern der Epidermis 86
3.3.2.2.4 Untersuchung der Präparate auf Immunzellen mittels Lederfärbung 87
3.3.2.2.5 Untersuchung der Basalmembrankomponenten Kollagen IV und
Integrin ß1 mittels Immunfluoreszenz 88
3.3.3 Tumorzellinvasion und Metastasierung 88
4 Diskussion 92
4.1 Nidogen-1 und -2 haben keinen Einfluss auf die Homöostase und
Morphogenese der Haut während der murinen Embryonalentwicklung 93
4.2 Die Basalmembranbildung der Kapillaren ist in Abwesenheit beider
Nidogen-Isoformen gestört 98
4.3 In Abwesenheit von Nidogen-1 kommt es zur Verzögerung von
Umbauprozessen während der Wundheilung 101
4.4 Die Barrierefunktion der Basalmembran der Blutgefäße ist in den
Nidogen-1 defizienten Tieren intakt 106
4.5 Ausblick 108
5 Zusammenfassung und Abstract 109
5.1 Zusammenfassung 109
5.2 Abstract 110
6 Literatur 112
Abkürzungen 128
Danksagung 129
Erklärung 130
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