Die Photorezeptor-Bandsynapse der Säuger-Retina: Untersuchungen zur Entwicklung, Struktur und Funktion einer komplexen chemischen Synapse
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2008
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| Online-Zugang: | Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:29-opus-10585 http://d-nb.info/990011313/34 Inhaltsverzeichnis |
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| adam_text | Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Chemische Synapsen 1
1.1.1 Aufbau und Funktion 1
1.1.2 Der Vesikelzyklus 2
1.1.3 Die aktive Zone chemischer Synapsen 3
1.2 Die Retina 6
1.2.1 Bandsynapsen der Säuger-Retina 8
1.2.2 Der molekulare Aufbau des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 9
1.2.2.1 Complexine an der Photorezeptor-Bandsynapse 10
1.3 Synaptogenese 11
1.4 Zielsetzung 13
2 ERGEBNISSE 14
2.1 Die postnatale Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der
wildtypischen Mausretina 14
2.1.1 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression von Bassoon während der
postnatalen Entwicklung der Retina 14
2.1.1.1 Lokalisation der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 16
2.1.2 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression weiterer CAZ-Proteine während der
postnatalen Entwicklung der Retina 18
2.1.3 STED-Analyse der Transport-Aggregate 19
2.1.4 Ultrastrukturelle Charakterisierung der Transport-Aggregate 20
2.1.5 Kolokalisationsstudien mit Antikörpern gegen Bassoon, Piccolo und RIBEYE 23
2.1.5.1 Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon und Piccolo mit Axiovison 4.6 23
2.1.5.2 Manuelle Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE anhand
von Tripelfärbungen 25
2.1.6 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 28
2.1.7 Die postnatale Expression von Proteinen des arciform density I Plasmamembran-
Kompartiments 31
2.1.7.1 Der Transport von in v/vo-markierten Munc 13-2-Proteinen 34
iii
Verzeichnisse
2.2 Die postnatale Entwicklung des präsynaptischen Bandes in Photorezeptoren der Bassoon-
mutanten Mausretina 36
2.2.1 Western Blot-Analyse der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen in der
Bassoon-mutanten Retina im Vergleich zum Wildtyp 37
2.2.2 Immunzytochemische Untersuchung von RIBEYE, Piccolo und RIM1 während der
postnatalen Entwicklung in der Bassoon-mutanten Retina 39
2.2.2.1 Kolokalisationstudie von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten Retina
zum Zeitpunkt P6 41
2.2.3 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-Bandes in
der Bassoon-mutanten Mausretina 43
2.3 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 46
2.3.1 Funktionsanalyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 46
2.3.2 Immunzytochemische Analyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 47
2.3.3 Analyse der Bandsynapsen-Struktur in Photorezeptoren der Complexin 3 und 4 Einzel- und
DKO-Retina 48
2.4 RNA Interferenz: Etablierung einer Methode zur funktionellen Untersuchung von
Proteinen des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 51
2.4.1 Die organotypische Explantkultivierung von Mausretina 52
2.4.2 Lentiviraler Gentransfer in die organotypische Retinakultur 55
2.4.3 Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren der ex vivo Retina 57
2.4.3.1 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD im
heterologen System 57
2.4.3.2 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS 16, FUGW TS28 und FUGW DKD in
Photorezeptoren der ex vivo Retina 58
3 DISKUSSION 60
3.1 Die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 61
3.1.1 Proteine des Bandsynaspen-Komplexes werden während der Photorezeptor-Synaptogenese
auf zwei unterschiedliche Arten transportiert 62
3.1.2 Precursor spheres: Die Transport-Aggregate von Zytomatrix-Proteinen des
präsynaptischen Bandes 63
3.1.3 Die Reifung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 65
3.1.4 Die Rolle von Bassoon in der Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 66
3.1.5 Die Entwicklung der aktiven Zone: Vergleich zwischen der Photorezeptor-Bandsynapse
und der konventionellen chemischen Synapse 69
iv
J5
Verzeichnisse
3.2 Die Proteinausstattung der Photorezeptor-Bandsynapse ist an die tonische
Transmitterausschüttung angepasst 70
3.2.1 Complexine 3 und 4: Zwei spezifische Complexin-Isoformen an der Photorezeptor-
Bandsynapse 71
3.2.1.1 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 72
3.2.1.2 Auswirkungen der Complexin 3 und 4-Deletion auf die Stabilität des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 73
3.3 Funktionelle Eingriffe in die Photorezeptor-Bandsynapse 75
3.3.1 Das Potential viraler Transfektion von Photorezeptoren 75
3.3.2 RNA Interferenz von Komponenten des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der ex
vivo Retina 76
4 MATERIAL UND METHODEN 79
4.1 Versuchstiere 79
4.2 Genotypisierung der Bassoon-mutanten Mäuse 79
4.2.1 Polymerase-Kettenreaktion 80
4.3 Präparation der Retina 80
4.4 Lichtmikroskopie 81
4.4.1 Fixierung und Herstellung von Gefrierschnitten für die Fluoreszenzmikroskopie 81
4.4.2 Immunzytochemische Färbungen 81
4.4.3 Wholemount-Färbung der Retina 82
4.4.4 Lichtmikroskopische Analyse 82
4.4.5 Bestimmung und Quantifizierung der Kolokalisation von Proteinen 82
4.4.6 STED-Mikroskopie 83
4.5 Elektronenmikroskopie 83
4.5.1 Fixierung für gute Gewebeerhaltung 83
4.5.2 Immunoelektronenmikroskopie: Preembedding 84
4.5.3 Elektronenmikroskopische Analyse 84
4.6 Western-Blot Analysen 85
4.6.1 Herstellung von Retina-Homogenaten 85
4.6.2 Proteinmengenbestimmung 85
4.6.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden
Bedingungen nach dem TrisAcetat-System 85
v
Verzeichnisse
4.6.4 Western Blot-Transfer und Analyse 86
4.7 Organotypische Explant-Kultivferung der Mäuseretina 87
4.8 Transfektion der organotypischen Retinakultur 87
4.8.1 Kultivierung von HEK 293T-Zellen 87
4.8.2 Generierung der Lentiviren 88
4.8.3 Durchführung der lentiviralen Transfektion von organotypischen Retinakulturen 88
4.9 RNA Interferenz 89
4.9.1 Auswahl geeigneter shRNA-Sequenzen 89
4.9.2 Konstruktion des Transfervektors FUGW Hl mit shRNA-Inserts 89
4.9.2.1 Restriktionsverdau von DNA 90
4.9.2.2 Ligation und Transformation von Bakterien 91
4.9.2.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 91
4.9.3 Analyse der Knockdown-Effizienz der shRNA-Konstrukte 91
4.10 Vektoren und Inserts 92
4.11 Lösungen und Medien 93
4.12 Chemikalien 95
4.13 Geräte und Hilfsmittel 98
4.14 Primärantikörper 100
4.15 Sekundärantikörper 101
5 ZUSAMMENFASSUNG 102
6 SUMMARY 104
7 LITERATURVERZEICHNIS 106
8 VIELEN DANK... 116
9 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 117
10 PUBLIKATIONEN 118
vi
Verzeichnisse
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Proteinen der aktiven Zone 4
Abbildung 2: Morphologische Variabilität aktiver Zonen in unterschiedlichen chemischen
Synapsentypen 5
Abbildung 3: Toluidinblau-gefarbter Vertikalschnitt durch die Säuger-Retina und schematische
Darstellung der Schichtung 7
Abbildung 4: Die Bandsynapsen der Säugerretina 8
Abbildung 5: Kompartimentierung von Proteinen am Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex 10
Abbildung 6: Elektronendichte Vesikel in den Axonen sich entwickelnder Neurone in 3 Tage alten
dissoziierten Hippocampus-Kulturen 12
Abbildung 7: Verteilungsmuster von Bassoon während der postnatalen Entwicklung der
wildtypischen Retina 15
Abbildung 8: Verteilung der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 17
Abbildung 9: Expressionsmuster von Piccolo, RIBEYE und RIM1 während der frühen postnatalen
Entwicklung der Retina 19
Abbildung 10: STED-Analyse der Bassoon-Aggregate in Photorezeptoren zum Zeitpunkt P2 20
Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Analyse der Transport-Aggregate in Photorezeptoren zum
Zeitpunkt P4 21
Abbildung 12: 3D-Rekonstruktion von precursor spheres in differenzierenden Photorezeptor-
Terminalien zum Zeitpunkt P4 22
Abbildung 13: Kolokalisation von Piccolo und Bassoon in der NBL zum Zeitpunkt P2 24
Abbildung 14: Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE an den Tagen P2 und P4 in der
NBL der wildtypischen Mausretina 26
Abbildung 15: Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE in precursor
spheres der sich differenzierenden Photorezeptoren 27
Abbildung 16: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der wildtypischen Retina 29
Abbildung 17: Verteilungsmuster von Muncl3 während der postnatalen Entwicklung in der
wildtypischen Retina 32
Abbildung 18: Verteilungsmuster von CAST1, RIM2 und der Ca2+-Kanal xl-Untereinheit während
der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina 33
Abbildung 19: Transport von Munc 13-2 während der Photorezeptor-Synaptogenese 35
Abbildung 20: Vergleich der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen der aktiven Zone
zwischen wildtypischer und Bassoon-mutanter Mausretina 37
Abbildung 21: Verteilungsmuster von RIBEYE während der postnatalen Entwicklung in der
Bassoon-mutanten Retina 40
vii
Verzeichnisse
Abbildung 22: Verteilungsmuster von Piccolo in der NBL der Bassoon-mutanten Mausretina 41
Abbildung 23: Kolokalisation von R1BEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten OPL zum
Zeitpunkt P6 42
Abbildung 24: Lokalisation von Piccolo-Aggregaten in Photorezeptoren der Bassoon-mutanten
Retina zum Zeitpunkt P6 43
Abbildung 25: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der Bassoon-mutanten Retina 45
Abbildung 26: Vergleich der Anatomie und neuronalen Morphologie zwischen wildtypischer und
Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 48
Abbildung 27: Degenerierte Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexe in der Complexin 3/4 DKO-
Retina 50
Abbildung 28: Die entwicklungsabhängige Expression von Bassoon in der ex vivo Retina 53
Abbildung 29: Präsynaptische Bänder in Photorezeptor-Terminalien der ex vivo Retina 54
Abbildung 30: Lentiviraler Gentransfer in die ex vivo Retina 56
Abbildung 31: Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in HEK293-
Zellen 58
Abbildung 32: Beispiele für einen erfolgten Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren
der ex vivo Retina 59
Abbildung 33: Wichtige Schritte in der Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes 66
Abbildung 34: Schematische Darstellung des Vektors FUGW Hl mit multiple cloning site 90
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Vektoren und Inserts 92
Tabelle 2: Verwendete Lösungen und Medien 93
Tabelle 3: Verwendete Chemikalien 95
Tabelle 4: Verwendete Geräte und Hilfsmittel 98
Tabelle 5: Verwendete Primärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 100
Tabelle 6: Verwendete Sekundärannkörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 101
viü
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Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Chemische Synapsen 1
1.1.1 Aufbau und Funktion 1
1.1.2 Der Vesikelzyklus 2
1.1.3 Die aktive Zone chemischer Synapsen 3
1.2 Die Retina 6
1.2.1 Bandsynapsen der Säuger-Retina 8
1.2.2 Der molekulare Aufbau des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 9
1.2.2.1 Complexine an der Photorezeptor-Bandsynapse 10
1.3 Synaptogenese 11
1.4 Zielsetzung 13
2 ERGEBNISSE 14
2.1 Die postnatale Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der
wildtypischen Mausretina 14
2.1.1 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression von Bassoon während der
postnatalen Entwicklung der Retina 14
2.1.1.1 Lokalisation der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 16
2.1.2 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression weiterer CAZ-Proteine während der
postnatalen Entwicklung der Retina 18
2.1.3 STED-Analyse der Transport-Aggregate 19
2.1.4 Ultrastrukturelle Charakterisierung der Transport-Aggregate 20
2.1.5 Kolokalisationsstudien mit Antikörpern gegen Bassoon, Piccolo und RIBEYE 23
2.1.5.1 Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon und Piccolo mit Axiovison 4.6 23
2.1.5.2 Manuelle Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE anhand
von Tripelfärbungen 25
2.1.6 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 28
2.1.7 Die postnatale Expression von Proteinen des arciform density I Plasmamembran-
Kompartiments 31
2.1.7.1 Der Transport von in v/vo-markierten Munc 13-2-Proteinen 34
iii
Verzeichnisse
2.2 Die postnatale Entwicklung des präsynaptischen Bandes in Photorezeptoren der Bassoon-
mutanten Mausretina 36
2.2.1 Western Blot-Analyse der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen in der
Bassoon-mutanten Retina im Vergleich zum Wildtyp 37
2.2.2 Immunzytochemische Untersuchung von RIBEYE, Piccolo und RIM1 während der
postnatalen Entwicklung in der Bassoon-mutanten Retina 39
2.2.2.1 Kolokalisationstudie von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten Retina
zum Zeitpunkt P6 41
2.2.3 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-Bandes in
der Bassoon-mutanten Mausretina 43
2.3 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 46
2.3.1 Funktionsanalyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 46
2.3.2 Immunzytochemische Analyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 47
2.3.3 Analyse der Bandsynapsen-Struktur in Photorezeptoren der Complexin 3 und 4 Einzel- und
DKO-Retina 48
2.4 RNA Interferenz: Etablierung einer Methode zur funktionellen Untersuchung von
Proteinen des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 51
2.4.1 Die organotypische Explantkultivierung von Mausretina 52
2.4.2 Lentiviraler Gentransfer in die organotypische Retinakultur 55
2.4.3 Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren der ex vivo Retina 57
2.4.3.1 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD im
heterologen System 57
2.4.3.2 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS 16, FUGW TS28 und FUGW DKD in
Photorezeptoren der ex vivo Retina 58
3 DISKUSSION 60
3.1 Die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 61
3.1.1 Proteine des Bandsynaspen-Komplexes werden während der Photorezeptor-Synaptogenese
auf zwei unterschiedliche Arten transportiert 62
3.1.2 Precursor spheres: Die Transport-Aggregate von Zytomatrix-Proteinen des
präsynaptischen Bandes 63
3.1.3 Die Reifung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 65
3.1.4 Die Rolle von Bassoon in der Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 66
3.1.5 Die Entwicklung der aktiven Zone: Vergleich zwischen der Photorezeptor-Bandsynapse
und der konventionellen chemischen Synapse 69
iv
J5
Verzeichnisse
3.2 Die Proteinausstattung der Photorezeptor-Bandsynapse ist an die tonische
Transmitterausschüttung angepasst 70
3.2.1 Complexine 3 und 4: Zwei spezifische Complexin-Isoformen an der Photorezeptor-
Bandsynapse 71
3.2.1.1 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 72
3.2.1.2 Auswirkungen der Complexin 3 und 4-Deletion auf die Stabilität des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 73
3.3 Funktionelle Eingriffe in die Photorezeptor-Bandsynapse 75
3.3.1 Das Potential viraler Transfektion von Photorezeptoren 75
3.3.2 RNA Interferenz von Komponenten des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der ex
vivo Retina 76
4 MATERIAL UND METHODEN 79
4.1 Versuchstiere 79
4.2 Genotypisierung der Bassoon-mutanten Mäuse 79
4.2.1 Polymerase-Kettenreaktion 80
4.3 Präparation der Retina 80
4.4 Lichtmikroskopie 81
4.4.1 Fixierung und Herstellung von Gefrierschnitten für die Fluoreszenzmikroskopie 81
4.4.2 Immunzytochemische Färbungen 81
4.4.3 Wholemount-Färbung der Retina 82
4.4.4 Lichtmikroskopische Analyse 82
4.4.5 Bestimmung und Quantifizierung der Kolokalisation von Proteinen 82
4.4.6 STED-Mikroskopie 83
4.5 Elektronenmikroskopie 83
4.5.1 Fixierung für gute Gewebeerhaltung 83
4.5.2 Immunoelektronenmikroskopie: Preembedding 84
4.5.3 Elektronenmikroskopische Analyse 84
4.6 Western-Blot Analysen 85
4.6.1 Herstellung von Retina-Homogenaten 85
4.6.2 Proteinmengenbestimmung 85
4.6.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden
Bedingungen nach dem TrisAcetat-System 85
v
Verzeichnisse
4.6.4 Western Blot-Transfer und Analyse 86
4.7 Organotypische Explant-Kultivferung der Mäuseretina 87
4.8 Transfektion der organotypischen Retinakultur 87
4.8.1 Kultivierung von HEK 293T-Zellen 87
4.8.2 Generierung der Lentiviren 88
4.8.3 Durchführung der lentiviralen Transfektion von organotypischen Retinakulturen 88
4.9 RNA Interferenz 89
4.9.1 Auswahl geeigneter shRNA-Sequenzen 89
4.9.2 Konstruktion des Transfervektors FUGW Hl mit shRNA-Inserts 89
4.9.2.1 Restriktionsverdau von DNA 90
4.9.2.2 Ligation und Transformation von Bakterien 91
4.9.2.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 91
4.9.3 Analyse der Knockdown-Effizienz der shRNA-Konstrukte 91
4.10 Vektoren und Inserts 92
4.11 Lösungen und Medien 93
4.12 Chemikalien 95
4.13 Geräte und Hilfsmittel 98
4.14 Primärantikörper 100
4.15 Sekundärantikörper 101
5 ZUSAMMENFASSUNG 102
6 SUMMARY 104
7 LITERATURVERZEICHNIS 106
8 VIELEN DANK. 116
9 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 117
10 PUBLIKATIONEN 118
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Verzeichnisse
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Proteinen der aktiven Zone 4
Abbildung 2: Morphologische Variabilität aktiver Zonen in unterschiedlichen chemischen
Synapsentypen 5
Abbildung 3: Toluidinblau-gefarbter Vertikalschnitt durch die Säuger-Retina und schematische
Darstellung der Schichtung 7
Abbildung 4: Die Bandsynapsen der Säugerretina 8
Abbildung 5: Kompartimentierung von Proteinen am Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex 10
Abbildung 6: Elektronendichte Vesikel in den Axonen sich entwickelnder Neurone in 3 Tage alten
dissoziierten Hippocampus-Kulturen 12
Abbildung 7: Verteilungsmuster von Bassoon während der postnatalen Entwicklung der
wildtypischen Retina 15
Abbildung 8: Verteilung der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 17
Abbildung 9: Expressionsmuster von Piccolo, RIBEYE und RIM1 während der frühen postnatalen
Entwicklung der Retina 19
Abbildung 10: STED-Analyse der Bassoon-Aggregate in Photorezeptoren zum Zeitpunkt P2 20
Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Analyse der Transport-Aggregate in Photorezeptoren zum
Zeitpunkt P4 21
Abbildung 12: 3D-Rekonstruktion von precursor spheres in differenzierenden Photorezeptor-
Terminalien zum Zeitpunkt P4 22
Abbildung 13: Kolokalisation von Piccolo und Bassoon in der NBL zum Zeitpunkt P2 24
Abbildung 14: Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE an den Tagen P2 und P4 in der
NBL der wildtypischen Mausretina 26
Abbildung 15: Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE in precursor
spheres der sich differenzierenden Photorezeptoren 27
Abbildung 16: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der wildtypischen Retina 29
Abbildung 17: Verteilungsmuster von Muncl3 während der postnatalen Entwicklung in der
wildtypischen Retina 32
Abbildung 18: Verteilungsmuster von CAST1, RIM2 und der Ca2+-Kanal xl-Untereinheit während
der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina 33
Abbildung 19: Transport von Munc 13-2 während der Photorezeptor-Synaptogenese 35
Abbildung 20: Vergleich der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen der aktiven Zone
zwischen wildtypischer und Bassoon-mutanter Mausretina 37
Abbildung 21: Verteilungsmuster von RIBEYE während der postnatalen Entwicklung in der
Bassoon-mutanten Retina 40
vii
Verzeichnisse
Abbildung 22: Verteilungsmuster von Piccolo in der NBL der Bassoon-mutanten Mausretina 41
Abbildung 23: Kolokalisation von R1BEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten OPL zum
Zeitpunkt P6 42
Abbildung 24: Lokalisation von Piccolo-Aggregaten in Photorezeptoren der Bassoon-mutanten
Retina zum Zeitpunkt P6 43
Abbildung 25: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der Bassoon-mutanten Retina 45
Abbildung 26: Vergleich der Anatomie und neuronalen Morphologie zwischen wildtypischer und
Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 48
Abbildung 27: Degenerierte Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexe in der Complexin 3/4 DKO-
Retina 50
Abbildung 28: Die entwicklungsabhängige Expression von Bassoon in der ex vivo Retina 53
Abbildung 29: Präsynaptische Bänder in Photorezeptor-Terminalien der ex vivo Retina 54
Abbildung 30: Lentiviraler Gentransfer in die ex vivo Retina 56
Abbildung 31: Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in HEK293-
Zellen 58
Abbildung 32: Beispiele für einen erfolgten Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren
der ex vivo Retina 59
Abbildung 33: Wichtige Schritte in der Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes 66
Abbildung 34: Schematische Darstellung des Vektors FUGW Hl mit multiple cloning site 90
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Vektoren und Inserts 92
Tabelle 2: Verwendete Lösungen und Medien 93
Tabelle 3: Verwendete Chemikalien 95
Tabelle 4: Verwendete Geräte und Hilfsmittel 98
Tabelle 5: Verwendete Primärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 100
Tabelle 6: Verwendete Sekundärannkörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 101
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