Polymorphismus der C-terminalen Polyaspartatdomäne der Phospodiesterase 3B bei Sprague Dawley Ratten:
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|---|---|
| adam_text | Inhalt
1. EINLEITUNG 1
1.1 Das zyklische Adenosinmonophosphat als sekundärer Botenstoff 2
1.2 Zyklische Nukleotid Phosphodiesterasen (PDE) 3
1.3 Domänenstruktur der Phosphodiesterasen 5
1.4 Bedeutung der Phosphodiesterasen 7
1.5 Die Phosphodiesterasefamilie 3 8
1.6 Aufgabenstellung 10
2. MATERIAL 11
2.1 Geräte und Software 11
2.2 Bakterienstämme/ Zelllinien/ Primärzellen 12
2.3 Vektoren 12
2.4 Primer 12
2.5 Enzyme 14
2.6 Standards 14
2.7 Kits 14
2.8 Inhibitoren, Chemikalien 14
2.9 Puffer 15
2.10 Medien 15
2.11 Untersuchungsmaterial 15
3. METHODEN 16
3.1 Präparation der Gewebe 16
3.2 Isolation genomischer DNA 17
3.3 Isolation von total-RNA 17
3.4 Reverse Transkription (cDNA Synthese) 18
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 19
3.6 NativeDNA-Agarosegelelektrophorese 20
Inhalt
3.7 Reinigung von PCR-Produkten 21
3.8 Klonierung 21
3.9 Plasmidpräparation im analytischen Maßstab (Miniprep) 23
3.10 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab (Maxiprep) 23
3.11 Restriktionsverdau 25
3.12 DNA Sequenzierung 26
3.13 Herstellung chemokompetenter E. coli 28
3.14 Proteinkonzentrationsbestimmung nachBradford (1976) 28
3.15 PCR-basierte Fragmentlängenanalyse 29
3.16 Phosphodiesterase-Aktivitätsmessung 30
3.17 Kultivierung und Passage von H4-Zellen 31
3.18 LightCycler cDNA Quantifizierung 31
4. ERGEBNISSE 34
4.1 PCR des Fragmentes PDE3B-Frl 34
4.2 Untersuchung der genomischen DNA 35
4.3 Suche nach weiteren Variationen 37
4.4 Zirkuläres versus lineares PCR Template 39
4.5 Fragmentlängenanalyse 41
4.6 Variantendes Polymorphismus in den einzelnen Tieren 43
4.7 Vererbungsmuster der Repeatsequenz 45
4.8 Klonierung der H4 Zelllinie 46
4.9 LightCycler PCR - lineares versus zirkuläres Template 46
4.10 PDE Muster in den Geweben 48
5. DISKUSSION 50
5.1 Lokalisation und Einfluss der Polyaspartatsequenz der PDE3B 50
5.2 Repeatsequenzen saurer Aminosäuren 51
5.3 Beurteilung der Fragmentlängenanalyse 53
Inhalt
5.4 Polymorphismen der GAT Repeatsequenz 54
5.5 Evolutionsbiologie von Triplettmutationen 55
5.6 Faktoren für die Deletion und Expansion von Triplettrepeats 56
5.7 Mathematisches Modell zur Fehlerberechnung 60
6. ZUSAMMENFASSUNG 64
7. ANHANG 66
7.1 Abkürzungen 66
7.2 Literaturverzeichnis 67
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 80
Lebenslauf 81
Danksagung 82
|
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Inhalt
1. EINLEITUNG 1
1.1 Das zyklische Adenosinmonophosphat als sekundärer Botenstoff 2
1.2 Zyklische Nukleotid Phosphodiesterasen (PDE) 3
1.3 Domänenstruktur der Phosphodiesterasen 5
1.4 Bedeutung der Phosphodiesterasen 7
1.5 Die Phosphodiesterasefamilie 3 8
1.6 Aufgabenstellung 10
2. MATERIAL 11
2.1 Geräte und Software 11
2.2 Bakterienstämme/ Zelllinien/ Primärzellen 12
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2.5 Enzyme 14
2.6 Standards 14
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2.8 Inhibitoren, Chemikalien 14
2.9 Puffer 15
2.10 Medien 15
2.11 Untersuchungsmaterial 15
3. METHODEN 16
3.1 Präparation der Gewebe 16
3.2 Isolation genomischer DNA 17
3.3 Isolation von total-RNA 17
3.4 Reverse Transkription (cDNA Synthese) 18
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 19
3.6 NativeDNA-Agarosegelelektrophorese 20
Inhalt
3.7 Reinigung von PCR-Produkten 21
3.8 Klonierung 21
3.9 Plasmidpräparation im analytischen Maßstab (Miniprep) 23
3.10 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab (Maxiprep) 23
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3.16 Phosphodiesterase-Aktivitätsmessung 30
3.17 Kultivierung und Passage von H4-Zellen 31
3.18 LightCycler cDNA Quantifizierung 31
4. ERGEBNISSE 34
4.1 PCR des Fragmentes PDE3B-Frl 34
4.2 Untersuchung der genomischen DNA 35
4.3 Suche nach weiteren Variationen 37
4.4 Zirkuläres versus lineares PCR Template 39
4.5 Fragmentlängenanalyse 41
4.6 Variantendes Polymorphismus in den einzelnen Tieren 43
4.7 Vererbungsmuster der Repeatsequenz 45
4.8 Klonierung der H4 Zelllinie 46
4.9 LightCycler PCR - lineares versus zirkuläres Template 46
4.10 PDE Muster in den Geweben 48
5. DISKUSSION 50
5.1 Lokalisation und Einfluss der Polyaspartatsequenz der PDE3B 50
5.2 Repeatsequenzen saurer Aminosäuren 51
5.3 Beurteilung der Fragmentlängenanalyse 53
Inhalt
5.4 Polymorphismen der GAT Repeatsequenz 54
5.5 Evolutionsbiologie von Triplettmutationen 55
5.6 Faktoren für die Deletion und Expansion von Triplettrepeats 56
5.7 Mathematisches Modell zur Fehlerberechnung 60
6. ZUSAMMENFASSUNG 64
7. ANHANG 66
7.1 Abkürzungen 66
7.2 Literaturverzeichnis 67
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