Die Rolle des MAP-Kinase-Signalwegs bei der antientzündlichen Wirkung von Glucocorticoiden und PDE4-Inhibitoren:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
2008
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| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | 159 S. Ill., graph. Darst. |
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|---|---|
| adam_text | Einführung
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Seite 11
1 Einführung 15
1.1 Chronisch-entzündliche Atemwegserkrankungen: Asthma
bronchiale und COPD (Chronisch-obstruktive Lungen¬
erkrankung) 15
1.1.1 Pathophysiologie 15
1.1.2 Die Entzündung auf zellulärer Ebene 17
1.2 Therapie beider Erkrankungen 19
1.2.1 Asthma 19
1.2.2 COPD 21
1.2.3 Neuere Therapieansätze 21
1.3 Molekulare Wirkmechanismen 24
1.3.1 Glucocorticoide 24
1.3.2 PDE4-Inhibitoren 31
1.4 Der MAP-Kinase-Signalweg 36
1.4.1 Die MAP-Kinasen ERK1/2, JNK und p38 36
1.4.2 Funktionelle Bedeutung und negativer Feedback über MKP-1 39
1.5 Zielstellung der Arbeit 41
2 Material und Methoden 42
2.1 Material 42
2.1.1 Substanzen und Verbrauchsmaterialien 42
2.1.2 Zelllinien und Zellkulturmedien 43
2.1.3 Primer 44
2.1.4 Antikörper 44
2.1.5 Pufferund Färbelösungen 45
2.1.6 Sonstiges 47
2.1.6.1 Polyacrylamidgel für Western Blot 47
2.1.6.2 Kits 47
2.1.6.3 siRNA 48
2.1.6.4 Sonstige verwendete Materialien, Geräte sowie Software 48
5
Einführung
2.2 Methoden 49
2.2.1 Isolierung von PBMC und Gewinnung primärer humaner
Monozyten aus Vollblut oder Buffy-Coat-Fraktionen 49
2.2.2 Behandlung und Stimulation von Monozyten 49
2.2.3 Kultivierung von U937- und HEK293-Zellen 50
2.2.4 RNA-Isolation 51
2.2.4.1 Isolation derTotal-RNA 51
2.2.4.2 Isolation derTotal-RNA inklusive miRNA 51
2.2.5 Quantitative RT-PCR 52
2.2.5.1 mRNA-Quantifizierung von diversen Genen mittels real-time
RT-PCR 52
2.2.5.2 TaqMan®MicroRNA Assay für hsa-miR-16-Bestimmung 53
2.2.6 ELISA 55
2.2.6.1 Zytokinmessung in Zellkulturüberständen 55
2.2.6.2 FACE™ ELISA für die Bestimmung von p38 MAPK 56
2.2.7 Western Blot 57
2.2.7.1 Probenaufbereitung, Gelelektrophorese und Durchführung der
Western Blots 57
2.2.7.2 Densitometrische Auswertung 58
2.2.8 Durchflusszytometrische Messungen 58
2.2.8.1 Prinzip 58
2.2.8.2 Propidiumiodid-Färbung zur Überprüfung der Zellviabilität 60
2.2.8.3 Messung von pp38 und pERK1/2 mittels phosphospezifischer
Antikörper 60
2.2.9 TransfektionmitValidatedStealth™ siRNA 61
2.2.10 /n-v/Vo-Untersuchungen 62
2.2.11 Datenauswertung 63
3 Ergebnisse 64
3.1 Untersuchungen zur antientzündlichen Wirkung von
Glucocorticoiden und PDE-Inhibitoren in vitro 64
3.1.1 Zeitverlauf der Expression von proinflammatorischen
Zytokinen in primären humanen Monozyten nach
Endotoxinstimulation 64
-
Einführung
3.1.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die Expression
von TNF-a- und IL-1ß-mRNA 65
3.1.3 Antagonisierung der Wirkung von Dexamethason auf das
proinflammatorische Zytokin TNF-a mittels GR-Antagonisten
RU486 66
3.1.4 FKBP51 als Marker für Glucocorticoidsensitivität/n vitro 67
3.1.5 Posttranskriptionelle Effekte von Glucocorticoiden und PDE4-
Inhibitoren 69
3.1.5.1 Destabilisierende Effekte auf Zytokin-mRNAs durch
Glucocorticoide bzw. PDE4-Inhibitoren 69
3.1.5.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf mRNA-
stabilisierende bzw. -destabilisierende Proteine 73
3.1.5.3 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf miR16 75
3.1.6 Expression von PDE-Isoformen in humanen Monozyten nach
Stimulation mitLPS 76
3.1.6.1 Einfluss von ausgewählten Glucocorticoiden und PDE-
Inhibitoren auf die Expression von inflammatorischen
Zytokinen sowie ICso-Bestimmungen 79
3.2 Einfluss beider antientzündlicher Substanzklassen auf den
MAP-Kinase-Signalweg 85
3.2.1 Aktivität der MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 in stimulierten
PBMC und Monozyten 85
3.2.1.1 Aktivität an relativem p38 in Monozyten und Beeinflussung
durch Dexamethason oder Rolipram 85
3.2.1.2 Zeitverlauf der pp38- und pERK1/2-Aktivierung nach
Endotoxinstimulation 86
3.2.1.3 Effekte von Dexamethason und Rolipram auf pp38 89
3.2.2 Expression von DUSP-lsoformen in humanen Monozyten 91
3.2.2.1 Expression von DUSP1-4 über einen Zeitverlauf von 24 h 91
3.2.2.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die Expression
von DUSP-lsoformen in unstimulierten Monozyten 91
3.2.3 Einfluss beider Substanzen auf die Expression von DUSP-
lsoformen nach Stimulation mit LPS 93
7
Einführung
3.2.4 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf MKP-1 -mRNA
im Zeitverlauf 94
3.2.5 Wirkung auf die MKP-1-Proteinbildung 95
3.2.6 Antagonisierung der MKP-1-Induktion von Dexamethason
mittels RU486 97
3.2.7 Wirkung von ausgewählten Glucocorticoiden auf die Induktion
von MKP-1-mRNA inklusive Dosis-Wirkungs-Kurven und
ECso-Bestimmung 98
3.2.8 Korrelation der ECso-Werte für MKP-1 mit den ICso-Werten für
TNF-a 100
3.3 Untersuchungen zur Inhibition von MKP-1 101
3.3.1 Konzentrationsabhängige Wirkung von Sanguinarin auf die
TNF-a-Proteinmenge in unstimulierten Monozyten und nach
Stimulation mit LPS 101
3.3.2 Einfluss des MKP-1-Inhibitors Sanguinarin auf die
Zellviabilität von humanen Monozyten 104
3.3.3 Antagonisierung der MKP-1-Wirkung von Dexamethason
durch den MKP-1-Inhibitor Sanguinarin 106
3.3.4 Inhibition von MKP-1 mittels RNA-Interferenz 107
3.4 Untersuchungen in vivo 109
3.4.1 Einfluss von Dexamethason auf pp38 und pERK1/2 nach
intranasaler LPS-Provokation 109
3.4.2 Expression von MKP-1-mRNA in murinen Lungen im
Zeitverlauf über 24 Stunden nach LPS-Provokation 110
3.4.3 Einfluss von Dexamethason auf MKP-1 in vivo 111
3.4.3.1 Aktivität an MKP-1-mRNA nach pulmonaler
Dexamethasonbehandlung 111
3.4.3.2 Induktion der MKP-1-mRNA durch Dexamethason nach LPS-
Behandlung 111
3.4.3.3 Einfluss von Dexamethason auf die MKP-1-Proteinaktivität in
murinen Lungen 112
3.4.4 Untersuchungen an MKP-1-knockout-Mäusen 114
3.4.4.1 Einfluss von Dexamethason auf die Zellinfiltration in der BAL
24 h nach LPS-Provokation 114
-
Einführung
3.4.4.2 Bestimmung der phosphospezifischen MAP-Kinasen p38 und
ERK1/2 115
4 Diskussion 116
4.1 Allgemeines und Testsystem 116
4.2 Antientzündliche Wirkung von Steroiden und PDE4-
Inhibitoren 119
4.2.1 Beeinflussung der proinflammatorischen Zytokine TNF-a und
IL-Iß 119
4.2.2 Rezeptorvermittelte TNF-a-Hemmwirkung von Gluco-
corticoiden 121
4.3 mRNA-Stabilität 121
4.3.1 Beeinflussung der mRNA-Stabilität von TNF-a und IL-1 ß nach
Transkriptionshemmung durch Actinomycin D 124
4.3.2 Regulatorische Proteine der mRNA-Stabilität 125
4.3.3 Bestimmung von humaner miRNA: hsa-miR16 127
4.3.4 Zusammenfassung der Wirkungen beider Substanzen auf
durch mRNA-Stabilität vermittelte Effekte 128
4.4 MKP-1 als negativer Regulator der p38 MAPK 129
4.4.1 Aktivierung von p38 durch LPS und p38-Hemmung durch
beide Arzneistoffe 129
4.4.2 Effekte von Steroiden und PDE4-Inhibitoren auf die Induktion
von MKP-1 131
4.4.3 Ausschalten der MKP-1: Antagonisierung der Phosphatase,
MKP-1-RNAi-Untersuchungen und MKP-1 -Knockout in vivo 132
4.5 Zusammenfassende Beantwortung der Fragestellung 136
4.6 Ausblick: pharmakologischer Einsatz einer MKP-1-Induktion 137
5 Zusammenfassung 139
6 Summary 141
7 Literaturverzeichnis 142
8 Anhang 151
8.1 Abbildungsverzeichnis 151
8.2 Tabellenverzeichnis 153
8.3 Verzeichnis der verwendeten Primer und Sonden 155
9
Einführung
9 Wissenschaftliche Beiträge 156
10 Danksagung 157
11 Lebenslauf 159
— - .
8 Anhang
8.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Pathophysiologie des Asthma bronchiale 16
Abbildung 2 Unterschiede zwischen Asthma und COPD hinsichtlich ihres
Entzündungsprofils 19
Abbildung 3 Regulation der Genexpression durch Corticosteroide 26
Abbildung 4 Mechanismus der GR-vermittelten Genrepression 28
Abbildung 5 Unterschiedliche Rolle von PDE-Isoenzymen bei der
Modulation des Aktivierungsstatus von cAMP- bzw. cGMP-
Signalwegen 32
Abbildung 6 Rolle der Phosphodiesterase 4 beim Abbau von cAMP in das
Mononukleotid AMP und mögliche Wirkungen von cAMP und
PDE4-Inhibitoren bei Asthma und COPD 34
Abbildung 7 Aktivierung der Genexpression durch MAP-Kinasen und Ihre
Inhibition durch MKP-1 38
Abbildung 8 Prinzip des FACE™ ELISA 56
Abbildung 9 Zeitverlauf der Zytokinexpressionen nach Stimulation mit LPS 64
Abbildung 10 Zeitverlauf der Zytokinexpressionen bei prophylaktischer
Substanzgabe von Dexamethason bzw. Rolipram und
Stimulation mit LPS 66
Abbildung 11 Antagonisierung der TNF-n-Hemmung von Dexamethason
mittels GR-Antagonist RU486 67
Abbildung 12 Expression von FKBPS1 durch Dexamethason in
unstimulierten Monozyten sowie nach Stimulation mit LPS 68
Abbildung 13 Dosisabhängige Expression von FKBP51-mRNA durch
Dexamethason 24 h nach LPS-Stimulation 68
Abbildung 14 mRNA-Destabilisierung mittels Actinomycin D - Elnfluss von
Dexamethason auf TNF-a- und IL-1ß-mRNA 71
Abbildung 15 mRNA-Destabilisierung mittels Actinomycin D - Einfluss von
Rolipram auf TNF-a-mRNA 72
Abbildung 16 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die mRNA-
Expression von HuR und TTP im Zeitverlauf über 24 h nach
Stimulation mit LPS 75
Abbildung 17 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf mlR16 im
Zeitverlauf über 24 h nach LPS-Stimulatlon 76
Abbildung 18 Expression von Phosphodiesterase-Isoformen in stimulierten
Monozyten: PDE3, -4 und -7 78
¦ — 151
Abbildung 19 Zytokininhibition durch ausgewählte Glucocorticoide: A IL-1ß-
mRNA; B TNF-a-mHNA; C, D TNF-a-Protein 81
Abbildung 20 Zytokininhibition durch ausgewählte PDE-Inhibitoren: A TNF-
a-mRNA, S TNF-a-Protein, CT0156 TNF-a-mRNA und -Protein 84
Abbildung 21 Relative Proteinmenge an pp38 zu p38 MAPK 30 min, 4 h und
24 h nach Stimulation in humanen Monozyten 86
Abbildung 22 Dot Plots zur Festlegung eines Analysenfensters auf die
Monozytenpopulation R1 87
Abbildung 23 Overlay-Histogramme für pp38 und pERK1/2 der stimulierten
Zeitwerte (10 min, 30 min, 2 h und 24 h nach LPS-Stimulation)
über die unstimulierte gefärbte Kontrolle nach Setzen eines
.Gates auf die Monozytenpopulation (G1) 88
Abbildung 24 Zeitlicher Verlauf der Aktivierung an pERK1/2 und pp38 MAPK
in humanen PBMC 89
Abbildung 25 Mittlere Fluoreszenzaktivität an pp38 in humanen PBMC nach
10 min bzw. 24 h mit und ohne LPS-Stimulation 90
Abbildung 26 Expression der DUSP1-4-mRNA in Monozyten 91
Abbildung 27 Zeitverlauf der Induktion von DUSP1-4 mRNA für
Dexamethason (A) und Rolipram (B) sowie beider Substanzen
im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (C) 93
Abbildung 28 Expression von DUSP1-4 in Monozyten 8 h nach LPS-
Stimulation 94
Abbildung 29 Kinetik der MKP-1-mRNA-lnduktion nach Stimulation mit LPS 95
Abbildung 30 MKP-1-Proteinbestimmung in humanen Monozyten 96
Abbildung 31 Antagonisierung der Steroid vermittelten Induktion von MKP-1
mittels GR-Antagonist RU486 97
Abbildung 32 Dosis-Wirkungs-Kurven und EC^-Werte der MKP-1 -mRNA-
Induktion durch ausgewählte Glucocorticoide 99
Abbildung 33 Korrelation der ICM-Werte für TNF-o mit EC50-Werten für
MKP-1 100
Abbildung 34 Sanguinarin-Konzentrationsreihe (1 nM bis 30 /jM) ohne
Stimulus (A) sowie stimuliert mit LPS [100 ng/ml] (B) 102
Abbildung 35 Aktivität an TNF-a-Protein in Monozyten nach Sanguinarin-
Behandlung (3 bis 3000 nM) und Stimulation mit LPS
10 ng/ml (A), 100 ng/ml (B) sowie 1 //g/ml (C) 104
Abbildung 36 Einfluss von Sanguinarin auf die Zellviabilität von humanen
Monozyten 105
Abbildung 37 Antagonisierung der Dexamethason vermittelten Inhibition
von TNF-a durch Sanguinarin nach Stimulation mit LPS
10 ng/ml (A) und 100 ng/ml (B) 106
152
Abbildung 38 Einfluss von MKP-1-siRNA in U937-Zellen bzw. HEK293-Zellen.... 108
Abbildung 39 Transfektion von HEK293 mit MKP-1-siRNA mit und ohne
Vorbehandlung durch Dexamethason 108
Abbildung 40 Einfluss von Dexamethason auf pp38 und pERK1 2: Mittlere
Fluoreszenzintensitätsänderung 2 h nach LPS-Behandlung 109
Abbildung 41 Zeitverlauf der MKP-1-mRNA-Expression in murinen Lungen 110
Abbildung 42 Aktivität an MKP-1-mRNA 20 min nach pulmonaler
Dexamethasongabe 111
Abbildung 43 Aktivität an MKP-1-mRNA In murinem Lungengewebe 2 h nach
LPS-Challenge 112
Abbildung 44 Aktivität an MKP-1 -Protein in murinem Lungengewebe 2 h
nach LPS-Challenge 113
Abbildung 45 Zellzahlen in der BAL von MKP-1 und Kontrollmäusen (C3H)
24 h nach intranasaler Stimulation mit LPS [0,5 mg/kg] 114
Abbildung 46 Mittlere Fluoreszenzintensitätsänderung an pp38 bzw.
pERK1/2 24 h nach LPS-Behandlung in MKP-1 - und
Kontrollmäusen (C3H) 115
Abbildung 47 Posttranskriptionelle Genregulation als Wirkmechanismus
von Glucocorticoiden 124
8.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 11
Tabelle 2 Substanzen und Verbrauchsmaterialien 42
Tabelle 3 Zelllinien und Zellkulturmedien 43
Tabelle 4 Verwendete Primer 44
Tabelle 5 Verwendete Antikörper 44
Tabelle 6 Puffer und Färbelösungen für Western Blot 45
Tabelle 7 Puffer für murine BAL 46
Tabelle 8 Zusammensetzung der Polyacrylamidgele (10 %) für Western
Blot 47
Tabelle 9 Verwendete Kits 47
Tabelle 10 Verwendete siRNA 48
Tabelle 11 Sonstige verwendete Materialien, Geräte und Software 48
Tabelle 12 Mastermix für RT-PCR 52
Tabelle 13 RT-Mastermix für TaqMan®MicroRNA Assay zur hsa-miR-16-
Bestimmung 54
Tabelle 14 Reverse-Transkriptions-Bedingungen für hsa-miR-16-
Bestimmung **
~~ 153
Tabelle 15 PCR-Reaktionsmix für TaqMan® MicroRNA Assay zur hsa-
miR-16-Bestimmung 55
Tabelle 16 BD FACScan ™-Gerätekonfiguration 59
Tabelle 17 Halbwertszeit [h] der TNF-a-mRNA nach
Transkriptionshemmung 70
Tabelle 18 IC^-Werte ausgewählter Glucocorticoide für TNF-a und IL-Iß
in primären humanen Monozyten 82
Tabelle 19 ICso-Werte ausgewählter PDE-Inhibitoren für TNF-u-Protein in
primären humanen Monozyten 84
Tabelle 20 Primer und Sonden für RT-PCR 155
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| adam_txt |
Einführung
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Seite 11
1 Einführung 15
1.1 Chronisch-entzündliche Atemwegserkrankungen: Asthma
bronchiale und COPD (Chronisch-obstruktive Lungen¬
erkrankung) 15
1.1.1 Pathophysiologie 15
1.1.2 Die Entzündung auf zellulärer Ebene 17
1.2 Therapie beider Erkrankungen 19
1.2.1 Asthma 19
1.2.2 COPD 21
1.2.3 Neuere Therapieansätze 21
1.3 Molekulare Wirkmechanismen 24
1.3.1 Glucocorticoide 24
1.3.2 PDE4-Inhibitoren 31
1.4 Der MAP-Kinase-Signalweg 36
1.4.1 Die MAP-Kinasen ERK1/2, JNK und p38 36
1.4.2 Funktionelle Bedeutung und negativer Feedback über MKP-1 39
1.5 Zielstellung der Arbeit 41
2 Material und Methoden 42
2.1 Material 42
2.1.1 Substanzen und Verbrauchsmaterialien 42
2.1.2 Zelllinien und Zellkulturmedien 43
2.1.3 Primer 44
2.1.4 Antikörper 44
2.1.5 Pufferund Färbelösungen 45
2.1.6 Sonstiges 47
2.1.6.1 Polyacrylamidgel für Western Blot 47
2.1.6.2 Kits 47
2.1.6.3 siRNA 48
2.1.6.4 Sonstige verwendete Materialien, Geräte sowie Software 48
5
Einführung
2.2 Methoden 49
2.2.1 Isolierung von PBMC und Gewinnung primärer humaner
Monozyten aus Vollblut oder Buffy-Coat-Fraktionen 49
2.2.2 Behandlung und Stimulation von Monozyten 49
2.2.3 Kultivierung von U937- und HEK293-Zellen 50
2.2.4 RNA-Isolation 51
2.2.4.1 Isolation derTotal-RNA 51
2.2.4.2 Isolation derTotal-RNA inklusive miRNA 51
2.2.5 Quantitative RT-PCR 52
2.2.5.1 mRNA-Quantifizierung von diversen Genen mittels real-time
RT-PCR 52
2.2.5.2 TaqMan®MicroRNA Assay für hsa-miR-16-Bestimmung 53
2.2.6 ELISA 55
2.2.6.1 Zytokinmessung in Zellkulturüberständen 55
2.2.6.2 FACE™ ELISA für die Bestimmung von p38 MAPK 56
2.2.7 Western Blot 57
2.2.7.1 Probenaufbereitung, Gelelektrophorese und Durchführung der
Western Blots 57
2.2.7.2 Densitometrische Auswertung 58
2.2.8 Durchflusszytometrische Messungen 58
2.2.8.1 Prinzip 58
2.2.8.2 Propidiumiodid-Färbung zur Überprüfung der Zellviabilität 60
2.2.8.3 Messung von pp38 und pERK1/2 mittels phosphospezifischer
Antikörper 60
2.2.9 TransfektionmitValidatedStealth™ siRNA 61
2.2.10 /n-v/Vo-Untersuchungen 62
2.2.11 Datenauswertung 63
3 Ergebnisse 64
3.1 Untersuchungen zur antientzündlichen Wirkung von
Glucocorticoiden und PDE-Inhibitoren in vitro 64
3.1.1 Zeitverlauf der Expression von proinflammatorischen
Zytokinen in primären humanen Monozyten nach
Endotoxinstimulation 64
-
Einführung
3.1.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die Expression
von TNF-a- und IL-1ß-mRNA 65
3.1.3 Antagonisierung der Wirkung von Dexamethason auf das
proinflammatorische Zytokin TNF-a mittels GR-Antagonisten
RU486 66
3.1.4 FKBP51 als Marker für Glucocorticoidsensitivität/n vitro 67
3.1.5 Posttranskriptionelle Effekte von Glucocorticoiden und PDE4-
Inhibitoren 69
3.1.5.1 Destabilisierende Effekte auf Zytokin-mRNAs durch
Glucocorticoide bzw. PDE4-Inhibitoren 69
3.1.5.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf mRNA-
stabilisierende bzw. -destabilisierende Proteine 73
3.1.5.3 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf miR16 75
3.1.6 Expression von PDE-Isoformen in humanen Monozyten nach
Stimulation mitLPS 76
3.1.6.1 Einfluss von ausgewählten Glucocorticoiden und PDE-
Inhibitoren auf die Expression von inflammatorischen
Zytokinen sowie ICso-Bestimmungen 79
3.2 Einfluss beider antientzündlicher Substanzklassen auf den
MAP-Kinase-Signalweg 85
3.2.1 Aktivität der MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 in stimulierten
PBMC und Monozyten 85
3.2.1.1 Aktivität an relativem p38 in Monozyten und Beeinflussung
durch Dexamethason oder Rolipram 85
3.2.1.2 Zeitverlauf der pp38- und pERK1/2-Aktivierung nach
Endotoxinstimulation 86
3.2.1.3 Effekte von Dexamethason und Rolipram auf pp38 89
3.2.2 Expression von DUSP-lsoformen in humanen Monozyten 91
3.2.2.1 Expression von DUSP1-4 über einen Zeitverlauf von 24 h 91
3.2.2.2 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die Expression
von DUSP-lsoformen in unstimulierten Monozyten 91
3.2.3 Einfluss beider Substanzen auf die Expression von DUSP-
lsoformen nach Stimulation mit LPS 93
7
Einführung
3.2.4 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf MKP-1 -mRNA
im Zeitverlauf 94
3.2.5 Wirkung auf die MKP-1-Proteinbildung 95
3.2.6 Antagonisierung der MKP-1-Induktion von Dexamethason
mittels RU486 97
3.2.7 Wirkung von ausgewählten Glucocorticoiden auf die Induktion
von MKP-1-mRNA inklusive Dosis-Wirkungs-Kurven und
ECso-Bestimmung 98
3.2.8 Korrelation der ECso-Werte für MKP-1 mit den ICso-Werten für
TNF-a 100
3.3 Untersuchungen zur Inhibition von MKP-1 101
3.3.1 Konzentrationsabhängige Wirkung von Sanguinarin auf die
TNF-a-Proteinmenge in unstimulierten Monozyten und nach
Stimulation mit LPS 101
3.3.2 Einfluss des MKP-1-Inhibitors Sanguinarin auf die
Zellviabilität von humanen Monozyten 104
3.3.3 Antagonisierung der MKP-1-Wirkung von Dexamethason
durch den MKP-1-Inhibitor Sanguinarin 106
3.3.4 Inhibition von MKP-1 mittels RNA-Interferenz 107
3.4 Untersuchungen in vivo 109
3.4.1 Einfluss von Dexamethason auf pp38 und pERK1/2 nach
intranasaler LPS-Provokation 109
3.4.2 Expression von MKP-1-mRNA in murinen Lungen im
Zeitverlauf über 24 Stunden nach LPS-Provokation 110
3.4.3 Einfluss von Dexamethason auf MKP-1 in vivo 111
3.4.3.1 Aktivität an MKP-1-mRNA nach pulmonaler
Dexamethasonbehandlung 111
3.4.3.2 Induktion der MKP-1-mRNA durch Dexamethason nach LPS-
Behandlung 111
3.4.3.3 Einfluss von Dexamethason auf die MKP-1-Proteinaktivität in
murinen Lungen 112
3.4.4 Untersuchungen an MKP-1-knockout-Mäusen 114
3.4.4.1 Einfluss von Dexamethason auf die Zellinfiltration in der BAL
24 h nach LPS-Provokation 114
-
Einführung
3.4.4.2 Bestimmung der phosphospezifischen MAP-Kinasen p38 und
ERK1/2 115
4 Diskussion 116
4.1 Allgemeines und Testsystem 116
4.2 Antientzündliche Wirkung von Steroiden und PDE4-
Inhibitoren 119
4.2.1 Beeinflussung der proinflammatorischen Zytokine TNF-a und
IL-Iß 119
4.2.2 Rezeptorvermittelte TNF-a-Hemmwirkung von Gluco-
corticoiden 121
4.3 mRNA-Stabilität 121
4.3.1 Beeinflussung der mRNA-Stabilität von TNF-a und IL-1 ß nach
Transkriptionshemmung durch Actinomycin D 124
4.3.2 Regulatorische Proteine der mRNA-Stabilität 125
4.3.3 Bestimmung von humaner miRNA: hsa-miR16 127
4.3.4 Zusammenfassung der Wirkungen beider Substanzen auf
durch mRNA-Stabilität vermittelte Effekte 128
4.4 MKP-1 als negativer Regulator der p38 MAPK 129
4.4.1 Aktivierung von p38 durch LPS und p38-Hemmung durch
beide Arzneistoffe 129
4.4.2 Effekte von Steroiden und PDE4-Inhibitoren auf die Induktion
von MKP-1 131
4.4.3 Ausschalten der MKP-1: Antagonisierung der Phosphatase,
MKP-1-RNAi-Untersuchungen und MKP-1 -Knockout in vivo 132
4.5 Zusammenfassende Beantwortung der Fragestellung 136
4.6 Ausblick: pharmakologischer Einsatz einer MKP-1-Induktion 137
5 Zusammenfassung 139
6 Summary 141
7 Literaturverzeichnis 142
8 Anhang 151
8.1 Abbildungsverzeichnis 151
8.2 Tabellenverzeichnis 153
8.3 Verzeichnis der verwendeten Primer und Sonden 155
9
Einführung
9 Wissenschaftliche Beiträge 156
10 Danksagung 157
11 Lebenslauf 159
— - .
8 Anhang
8.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Pathophysiologie des Asthma bronchiale 16
Abbildung 2 Unterschiede zwischen Asthma und COPD hinsichtlich ihres
Entzündungsprofils 19
Abbildung 3 Regulation der Genexpression durch Corticosteroide 26
Abbildung 4 Mechanismus der GR-vermittelten Genrepression 28
Abbildung 5 Unterschiedliche Rolle von PDE-Isoenzymen bei der
Modulation des Aktivierungsstatus von cAMP- bzw. cGMP-
Signalwegen 32
Abbildung 6 Rolle der Phosphodiesterase 4 beim Abbau von cAMP in das
Mononukleotid AMP und mögliche Wirkungen von cAMP und
PDE4-Inhibitoren bei Asthma und COPD 34
Abbildung 7 Aktivierung der Genexpression durch MAP-Kinasen und Ihre
Inhibition durch MKP-1 38
Abbildung 8 Prinzip des FACE™ ELISA 56
Abbildung 9 Zeitverlauf der Zytokinexpressionen nach Stimulation mit LPS 64
Abbildung 10 Zeitverlauf der Zytokinexpressionen bei prophylaktischer
Substanzgabe von Dexamethason bzw. Rolipram und
Stimulation mit LPS 66
Abbildung 11 Antagonisierung der TNF-n-Hemmung von Dexamethason
mittels GR-Antagonist RU486 67
Abbildung 12 Expression von FKBPS1 durch Dexamethason in
unstimulierten Monozyten sowie nach Stimulation mit LPS 68
Abbildung 13 Dosisabhängige Expression von FKBP51-mRNA durch
Dexamethason 24 h nach LPS-Stimulation 68
Abbildung 14 mRNA-Destabilisierung mittels Actinomycin D - Elnfluss von
Dexamethason auf TNF-a- und IL-1ß-mRNA 71
Abbildung 15 mRNA-Destabilisierung mittels Actinomycin D - Einfluss von
Rolipram auf TNF-a-mRNA 72
Abbildung 16 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf die mRNA-
Expression von HuR und TTP im Zeitverlauf über 24 h nach
Stimulation mit LPS 75
Abbildung 17 Einfluss von Dexamethason und Rolipram auf mlR16 im
Zeitverlauf über 24 h nach LPS-Stimulatlon 76
Abbildung 18 Expression von Phosphodiesterase-Isoformen in stimulierten
Monozyten: PDE3, -4 und -7 78
¦ — ' ' 151
Abbildung 19 Zytokininhibition durch ausgewählte Glucocorticoide: A IL-1ß-
mRNA; B TNF-a-mHNA; C, D TNF-a-Protein 81
Abbildung 20 Zytokininhibition durch ausgewählte PDE-Inhibitoren: A TNF-
a-mRNA, S TNF-a-Protein, CT0156 TNF-a-mRNA und -Protein 84
Abbildung 21 Relative Proteinmenge an pp38 zu p38 MAPK 30 min, 4 h und
24 h nach Stimulation in humanen Monozyten 86
Abbildung 22 Dot Plots zur Festlegung eines Analysenfensters auf die
Monozytenpopulation R1 87
Abbildung 23 Overlay-Histogramme für pp38 und pERK1/2 der stimulierten
Zeitwerte (10 min, 30 min, 2 h und 24 h nach LPS-Stimulation)
über die unstimulierte gefärbte Kontrolle nach Setzen eines
.Gates' auf die Monozytenpopulation (G1) 88
Abbildung 24 Zeitlicher Verlauf der Aktivierung an pERK1/2 und pp38 MAPK
in humanen PBMC 89
Abbildung 25 Mittlere Fluoreszenzaktivität an pp38 in humanen PBMC nach
10 min bzw. 24 h mit und ohne LPS-Stimulation 90
Abbildung 26 Expression der DUSP1-4-mRNA in Monozyten 91
Abbildung 27 Zeitverlauf der Induktion von DUSP1-4 mRNA für
Dexamethason (A) und Rolipram (B) sowie beider Substanzen
im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (C) 93
Abbildung 28 Expression von DUSP1-4 in Monozyten 8 h nach LPS-
Stimulation 94
Abbildung 29 Kinetik der MKP-1-mRNA-lnduktion nach Stimulation mit LPS 95
Abbildung 30 MKP-1-Proteinbestimmung in humanen Monozyten 96
Abbildung 31 Antagonisierung der Steroid vermittelten Induktion von MKP-1
mittels GR-Antagonist RU486 97
Abbildung 32 Dosis-Wirkungs-Kurven und EC^-Werte der MKP-1 -mRNA-
Induktion durch ausgewählte Glucocorticoide 99
Abbildung 33 Korrelation der ICM-Werte für TNF-o mit EC50-Werten für
MKP-1 100
Abbildung 34 Sanguinarin-Konzentrationsreihe (1 nM bis 30 /jM) ohne
Stimulus (A) sowie stimuliert mit LPS [100 ng/ml] (B) 102
Abbildung 35 Aktivität an TNF-a-Protein in Monozyten nach Sanguinarin-
Behandlung (3 bis 3000 nM) und Stimulation mit LPS
10 ng/ml (A), 100 ng/ml (B) sowie 1 //g/ml (C) 104
Abbildung 36 Einfluss von Sanguinarin auf die Zellviabilität von humanen
Monozyten 105
Abbildung 37 Antagonisierung der Dexamethason vermittelten Inhibition
von TNF-a durch Sanguinarin nach Stimulation mit LPS
10 ng/ml (A) und 100 ng/ml (B) 106
152
Abbildung 38 Einfluss von MKP-1-siRNA in U937-Zellen bzw. HEK293-Zellen. 108
Abbildung 39 Transfektion von HEK293 mit MKP-1-siRNA mit und ohne
Vorbehandlung durch Dexamethason 108
Abbildung 40 Einfluss von Dexamethason auf pp38 und pERK1 2: Mittlere
Fluoreszenzintensitätsänderung 2 h nach LPS-Behandlung 109
Abbildung 41 Zeitverlauf der MKP-1-mRNA-Expression in murinen Lungen 110
Abbildung 42 Aktivität an MKP-1-mRNA 20 min nach pulmonaler
Dexamethasongabe 111
Abbildung 43 Aktivität an MKP-1-mRNA In murinem Lungengewebe 2 h nach
LPS-Challenge 112
Abbildung 44 Aktivität an MKP-1 -Protein in murinem Lungengewebe 2 h
nach LPS-Challenge 113
Abbildung 45 Zellzahlen in der BAL von MKP-1 "'' und Kontrollmäusen (C3H)
24 h nach intranasaler Stimulation mit LPS [0,5 mg/kg] 114
Abbildung 46 Mittlere Fluoreszenzintensitätsänderung an pp38 bzw.
pERK1/2 24 h nach LPS-Behandlung in MKP-1 "'"- und
Kontrollmäusen (C3H) 115
Abbildung 47 Posttranskriptionelle Genregulation als Wirkmechanismus
von Glucocorticoiden 124
8.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 11
Tabelle 2 Substanzen und Verbrauchsmaterialien 42
Tabelle 3 Zelllinien und Zellkulturmedien 43
Tabelle 4 Verwendete Primer 44
Tabelle 5 Verwendete Antikörper 44
Tabelle 6 Puffer und Färbelösungen für Western Blot 45
Tabelle 7 Puffer für murine BAL 46
Tabelle 8 Zusammensetzung der Polyacrylamidgele (10 %) für Western
Blot 47
Tabelle 9 Verwendete Kits 47
Tabelle 10 Verwendete siRNA 48
Tabelle 11 Sonstige verwendete Materialien, Geräte und Software 48
Tabelle 12 Mastermix für RT-PCR 52
Tabelle 13 RT-Mastermix für TaqMan®MicroRNA Assay zur hsa-miR-16-
Bestimmung 54
Tabelle 14 Reverse-Transkriptions-Bedingungen für hsa-miR-16-
Bestimmung **
" ~~ " 153
Tabelle 15 PCR-Reaktionsmix für TaqMan® MicroRNA Assay zur hsa-
miR-16-Bestimmung 55
Tabelle 16 BD FACScan ™-Gerätekonfiguration 59
Tabelle 17 Halbwertszeit [h] der TNF-a-mRNA nach
Transkriptionshemmung 70
Tabelle 18 IC^-Werte ausgewählter Glucocorticoide für TNF-a und IL-Iß
in primären humanen Monozyten 82
Tabelle 19 ICso-Werte ausgewählter PDE-Inhibitoren für TNF-u-Protein in
primären humanen Monozyten 84
Tabelle 20 Primer und Sonden für RT-PCR 155
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