Untersuchungen zur Funktion von PAR-Typ-Thrombinrezeptoren in humanen HEP-3B-Leberkarzinomzellen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis VII
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung .3.
2.1. Das hepatozelluläre Karzinom 3
2.1.1. Epidemiologie .3.
2.1.2. Kurze Darstellung des HCC .3.
2.2. Proteinase-aktivierte Rezeptoren (PARs) 6
2.2.1. PAR-Typ-Thrombinrezeptoren .6
2.2.1.1. Struktur ß.
2.2.1.2. Aktivierungsmechanismus 7
2.2.1.3. G-Protein-Kopplung 9
2.2.1.4. Signaltransduktion 14
2.2.1.5. Inaktivierung Ig
2.2.1.6. Funktionen 17
2.2.1.7. PAR-Typ-Thrombinrezeptoren und Tumor Ig
2.3. Mitogen-aktivierte Proteinkinasen 22
2.3.1. Extrazellulär Signal-regulierte Kinasen 2.2
2.3.1.1. Struktur 2.3..
2.3.1.2. Aktivierung 24
2.3.1.3. Inaktivierung 2ß.
2.3.1.4. Signaltransduktion 27
2.3.1.5. Funktion 29.
2.3.1.6. ERK1/2 und Tumor 30
3. Zielstellung 3.2
4. Material und Methoden .3.3.
4.1. Material 3.3
4.1.1. Zelllinie 3.2
4.1.2. PAR-aktivierende Peptide 3.3.
4.1.3. Chemikalien, Verbrauchsmaterialien 3.3
4.1.4. Pufferlösungen und Lösungen 3.8
Inhaltsverzeichnis V||[
4.1.5. Geräte 3.9.
4.2. Methoden 42
4.2.1. Zellkultur 4.2.
4.2.1.1. Kultivierung der Zellen 42
4.2.1.2. Einfrieren der Zellen .42
4.2.1.3. Auftauen der Zellen 42
4.2.1.4. Zellzahlbestimmung 43
4.2.2. Gesamt-RNA-Isolation 4.3
4.2.3. Polymerasekettenreaktion und Agarose-
Gelelektrophorese 43.
4.2.4. Herstellung von HEP-3B-Zelllysaten .4.5.
4.2.5. Proteinbestimmung 45.
4.2.6. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 46.
4.2.7. Western Blotting .4.6.
4.2.8. Membran-Stripping und ERK-Blotting .4.7
4.2.9. Untersuchungen zur chemotaktischen Zellmigration 4.7
4.210. Statistische Auswertung der Migrationsdaten 4.8.
5. Ergebnisse 4.9.
5.1. HEP-3B-Zellen exprimieren die Thrombinrezeptoren
PARi, PAR3 und PAR4. 49
5.2. Thrombin induziert in HEP-3B-Zellen eine ERK-Aktivierung 49
5.3. Das selektiv PAR1 -aktivierende Peptid TFLLRN,
aber nicht das selektiv PAR4-aktivierende Peptid AYPGKF
induziert in HEP-3B-Zellen eineERK-Aktivierung 50
5.4. Der PAR3-blockierende Antikörper Kauf-17 hat in HEP-3B-Zellen
keinen Effekt auf die Thrombin-induzierte ERK-Aktivierung 51.
5.5. Die Aktivierung von PAR1 führt zu einer erhöhten Migration
von HEP-3B-Zellen 52
5.6. Der PARrvermittelte Effekt auf die Migration von
HEP-3B-Zellen ist MAPK-abhängig 53..
Inhaltsverzeichnis jX^
6. Diskussion jjg
6.1. Auswahl des zellulären Modells 56
6.2. PARi vermittelt in HEP-3B-Zellen eine ERK-Aktivierung 56
6.3. PARi vermittelt eine Erhöhung der Migration von
HEP-3B-Zellen über einen MAPK-abhängigen Mechanismus, 58
7. Schlussfolgerungen ßß
8. Literaturverzeichnis $2
Anhang
Danksagung 77
Lebenslauf 78
Ehrenwörtliche Erklärung 79
Abbildungsverzeichnis V^
Abbildungsverzeichnis
Abb.1: Struktur der Proteinase-aktivierten Rezeptoren 1, 3 und 4.
Abb.2: Aktivierung der Proteinase-aktivierten Rezeptoren.
Abb.3: PARrSignaltransduktion.
Abb.4: ERK-Kopplung an PARl
Abb.5: ERK1/2-Strukturmodell -nichtphosphorylierter Zustand.
Abb.6: Aktivierungskaskade von ERK1/2.
Abb.7: Signaltransduktion von ERK1/2.
Abb.8: Expression von PARr, PAR3-, PAR4- und ß-Aktin-RNA in
HEP-3B-Zellen.
Abb.9: Effekt von Thrombin auf die Aktivierung von ERK1/2.
Abb.10: Effekt des PARrAPs (TFLLRN), des negativen PARrKontrollpeptids
(NRLLFT) und des PAR4-APs (AYPGKF) auf die Aktivierung von
ERK1/2.
Abb.11: Effekt des PAR3-AK Kauf-17 auf die Thrombin-induzierte Aktivierung
von ERK1/2.
Abb.12: Effekt von Thrombin, PARrAP (TFLLRN) sowie des PARrAntagonisten
SCH 79797 auf das Migrationsverhalten von HEP-3B-Zellen.
Abb.13: Effekt von PD 98059 auf die PARrAP (TFLLRN)-stimulierte Migration
von HEP-3B-Zellen.
Tabellenverzeichnis Vj_
Tabellenverzeichnis
Tab.1: Effektoren für G-Proteinuntereinheiten.
Tab.2: Klassifikation, Verbreitung und Funktion der Ga-Untereinheiten.
Tab.3: Isoformen und Expression der Gß- und Gy-Untereinheiten.
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis VII
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung .3.
2.1. Das hepatozelluläre Karzinom 3
2.1.1. Epidemiologie .3.
2.1.2. Kurze Darstellung des HCC .3.
2.2. Proteinase-aktivierte Rezeptoren (PARs) 6
2.2.1. PAR-Typ-Thrombinrezeptoren .6
2.2.1.1. Struktur ß.
2.2.1.2. Aktivierungsmechanismus 7
2.2.1.3. G-Protein-Kopplung 9
2.2.1.4. Signaltransduktion 14
2.2.1.5. Inaktivierung Ig
2.2.1.6. Funktionen 17
2.2.1.7. PAR-Typ-Thrombinrezeptoren und Tumor Ig
2.3. Mitogen-aktivierte Proteinkinasen 22
2.3.1. Extrazellulär Signal-regulierte Kinasen 2.2
2.3.1.1. Struktur 2.3.
2.3.1.2. Aktivierung 24
2.3.1.3. Inaktivierung 2ß.
2.3.1.4. Signaltransduktion 27
2.3.1.5. Funktion 29.
2.3.1.6. ERK1/2 und Tumor 30
3. Zielstellung 3.2
4. Material und Methoden .3.3.
4.1. Material 3.3
4.1.1. Zelllinie 3.2
4.1.2. PAR-aktivierende Peptide 3.3.
4.1.3. Chemikalien, Verbrauchsmaterialien 3.3
4.1.4. Pufferlösungen und Lösungen 3.8
Inhaltsverzeichnis V||[
4.1.5. Geräte 3.9.
4.2. Methoden 42
4.2.1. Zellkultur 4.2.
4.2.1.1. Kultivierung der Zellen 42
4.2.1.2. Einfrieren der Zellen .42
4.2.1.3. Auftauen der Zellen 42
4.2.1.4. Zellzahlbestimmung 43
4.2.2. Gesamt-RNA-Isolation 4.3
4.2.3. Polymerasekettenreaktion und Agarose-
Gelelektrophorese 43.
4.2.4. Herstellung von HEP-3B-Zelllysaten .4.5.
4.2.5. Proteinbestimmung 45.
4.2.6. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 46.
4.2.7. Western Blotting .4.6.
4.2.8. Membran-Stripping und ERK-Blotting .4.7
4.2.9. Untersuchungen zur chemotaktischen Zellmigration 4.7
4.210. Statistische Auswertung der Migrationsdaten 4.8.
5. Ergebnisse 4.9.
5.1. HEP-3B-Zellen exprimieren die Thrombinrezeptoren
PARi, PAR3 und PAR4. 49
5.2. Thrombin induziert in HEP-3B-Zellen eine ERK-Aktivierung 49
5.3. Das selektiv PAR1 -aktivierende Peptid TFLLRN,
aber nicht das selektiv PAR4-aktivierende Peptid AYPGKF
induziert in HEP-3B-Zellen eineERK-Aktivierung 50
5.4. Der PAR3-blockierende Antikörper Kauf-17 hat in HEP-3B-Zellen
keinen Effekt auf die Thrombin-induzierte ERK-Aktivierung 51.
5.5. Die Aktivierung von PAR1 führt zu einer erhöhten Migration
von HEP-3B-Zellen 52
5.6. Der PARrvermittelte Effekt auf die Migration von
HEP-3B-Zellen ist MAPK-abhängig 53.
Inhaltsverzeichnis jX^
6. Diskussion jjg
6.1. Auswahl des zellulären Modells 56
6.2. PARi vermittelt in HEP-3B-Zellen eine ERK-Aktivierung 56
6.3. PARi vermittelt eine Erhöhung der Migration von
HEP-3B-Zellen über einen MAPK-abhängigen Mechanismus, 58
7. Schlussfolgerungen ßß
8. Literaturverzeichnis $2
Anhang
Danksagung 77
Lebenslauf 78
Ehrenwörtliche Erklärung 79
Abbildungsverzeichnis V^
Abbildungsverzeichnis
Abb.1: Struktur der Proteinase-aktivierten Rezeptoren 1, 3 und 4.
Abb.2: Aktivierung der Proteinase-aktivierten Rezeptoren.
Abb.3: PARrSignaltransduktion.
Abb.4: ERK-Kopplung an PARl
Abb.5: ERK1/2-Strukturmodell -nichtphosphorylierter Zustand.
Abb.6: Aktivierungskaskade von ERK1/2.
Abb.7: Signaltransduktion von ERK1/2.
Abb.8: Expression von PARr, PAR3-, PAR4- und ß-Aktin-RNA in
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Abb.9: Effekt von Thrombin auf die Aktivierung von ERK1/2.
Abb.10: Effekt des PARrAPs (TFLLRN), des negativen PARrKontrollpeptids
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ERK1/2.
Abb.11: Effekt des PAR3-AK Kauf-17 auf die Thrombin-induzierte Aktivierung
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