Aktivierung des Hämostasesystems durch Endotoxin-stimulierte Monozyten: eine In-vitro-Untersuchung
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2007
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 5
1. Einleitung 7
1.1 Das Hämostasesystem im Überblick 7
1.1.1 Physiologische Aktivierungmechanismen des Hämostasesystems 8
1.1.2 Inhibitoren des Hämostasesystems 11
1.1.3 Die Fibrinolyse 12
1.1.4 Die Rolle der Thrombozyten 13
1.2 Die pathologische Gerinnungsaktivierung 14
1.2.1 Tissue Faktor (TF) 14
1.2.2 Monozyten 17
12.3 Tissue Faktor-Expression auf Monozyten 18
1.2.4 Sepsis und disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) 22
1 3 Fragestellung und Zielsetzung 26
2. Material 28
2.1 Geräte 28
2.2 Reagenzien und Lösungen 29
2.3 Verbrauchsmaterialien 31
3. Methoden 32
3.1 Gewinnung und Präparation von Citratvollblutproben 32
3.2 Thrombelastographie (TEG) 35
3.3 Grundlagen und Durchführung der PCR 39
3.3.1 Isolation und Reinigung von TF-mRNA 39
3.3.2 Quantitative Bestimmung der TF-mRNA mit der Real-Time-PCR 41
4
3.4 Bestimmung der TF-Aktivität aus Citratvollblut 46
3.5 Quantitative Bestimmung der Faktor Vlla-Konzentration 47
3.6 Immunologische Bestimmung von Thrombin-Antithrombin-Ill-Komplex
(TAT) 49
3.7 Immunologische Bestimmung von Prothrombinfragment 1.2 (F 1.2) 50
3.8 Monozytenzählung aus dem Differentialblutbild 52
3.9 Statistik 53
4. Versuche und Ergebnisse M
4.1 Nachweis der TF-induzierten Gerinnungsaktivierung im Vollblut
mit der Thrombelastographie 54
4.1.1 Ermittlung der Nachweisgrenze und Quantifizierung 54
4.1.2 Reproduzierbarkeit und interindividuelle Variabilität 55
4.2 Kinetik der Endotoxin-induzierten Gerinnungsaktivierung im Vollblut 62
4.3 Korrelation zwischen monozytärer TF-Expression und der
Gerinnungsaktivierung im Vollblut 67
4.3.1 Quantifizierung der LPS-induzierten TF-Expression 67
4.3.2 Einfluss der LPS-Inkubation auf die im TEG messbaren
Gerinnungszeiten (Gerinnungsaktivierung) 77
4.3.3 Nachweis der LPS-Wirkung durch die molekularen Biomarker FVIIa,
F1.2 und TAT 77
4.3.4 Vergleich zwischen der erwarteten Gerinnungsaktivierung und der
gemessenen Gerinnungsaktivierung 89
5. Diskussion 90
6. Zusammenfassung 102
7. Anhang 103
8. Literaturverzeichnis 118
9. Danksagung 134
10. Lebenslauf 135
|
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3
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 5
1. Einleitung 7
1.1 Das Hämostasesystem im Überblick 7
1.1.1 Physiologische Aktivierungmechanismen des Hämostasesystems 8
1.1.2 Inhibitoren des Hämostasesystems 11
1.1.3 Die Fibrinolyse 12
1.1.4 Die Rolle der Thrombozyten 13
1.2 Die pathologische Gerinnungsaktivierung 14
1.2.1 Tissue Faktor (TF) 14
1.2.2 Monozyten 17
12.3 Tissue Faktor-Expression auf Monozyten 18
1.2.4 Sepsis und disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) 22
1 3 Fragestellung und Zielsetzung 26
2. Material 28
2.1 Geräte 28
2.2 Reagenzien und Lösungen 29
2.3 Verbrauchsmaterialien 31
3. Methoden 32
3.1 Gewinnung und Präparation von Citratvollblutproben 32
3.2 Thrombelastographie (TEG) 35
3.3 Grundlagen und Durchführung der PCR 39
3.3.1 Isolation und Reinigung von TF-mRNA 39
3.3.2 Quantitative Bestimmung der TF-mRNA mit der Real-Time-PCR 41
4
3.4 Bestimmung der TF-Aktivität aus Citratvollblut 46
3.5 Quantitative Bestimmung der Faktor Vlla-Konzentration 47
3.6 Immunologische Bestimmung von Thrombin-Antithrombin-Ill-Komplex
(TAT) 49
3.7 Immunologische Bestimmung von Prothrombinfragment 1.2 (F 1.2) 50
3.8 Monozytenzählung aus dem Differentialblutbild 52
3.9 Statistik 53
4. Versuche und Ergebnisse M
4.1 Nachweis der TF-induzierten Gerinnungsaktivierung im Vollblut
mit der Thrombelastographie 54
4.1.1 Ermittlung der Nachweisgrenze und Quantifizierung 54
4.1.2 Reproduzierbarkeit und interindividuelle Variabilität 55
4.2 Kinetik der Endotoxin-induzierten Gerinnungsaktivierung im Vollblut 62
4.3 Korrelation zwischen monozytärer TF-Expression und der
Gerinnungsaktivierung im Vollblut 67
4.3.1 Quantifizierung der LPS-induzierten TF-Expression 67
4.3.2 Einfluss der LPS-Inkubation auf die im TEG messbaren
Gerinnungszeiten (Gerinnungsaktivierung) 77
4.3.3 Nachweis der LPS-Wirkung durch die molekularen Biomarker FVIIa,
F1.2 und TAT 77
4.3.4 Vergleich zwischen der erwarteten Gerinnungsaktivierung und der
gemessenen Gerinnungsaktivierung 89
5. Diskussion 90
6. Zusammenfassung 102
7. Anhang 103
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