Steigerung der Immunrezeptor-vermittelten T-Zell Antwort mit Hilfe von IL-12:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 13
2 EINLEITUNG 15
2.1 Das kolorektale Karzinom 15
2.2 Das carcinoembryonale Antigen 16
2.3 Die adoptive Immuntherapie 17
2.4 Rekombinante Immunrezeptoren 19
2.5 Synergistische Effekte von rekombinanten Immunrezeptoren und Zytokinen 22
2.6 IL 12 23
2.6.1 Das anti Tumor Potential von IL 12 24
3 ZIELSETZUNG 25
4 MATERIAL UND METHODEN 26
4.1 Material 26
4.1.1 Stammlösungen und Puffer 26
4.1.2 Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese 26
4.1.3 Größenmarker für die Gel Elektrophorese 27
4.1.4 Medien für Bakterienkultur und Medienzusätze 27
4.1.5 Bakterienstämme 28
4.16 Zelllinien 28
4.1.7 Medien für die Zellkultur und Medienzusätze 29
4.1.8 Antikörper und Antiseren 30
4.1.8.1 Primärantikörper 30
4.1.8.2 Konjugierte Sekundärantikörper 31
4.1.9 Antiseren 32
4.1.10 Sonstige Proteine 33
4.1.11 Restriktionsendonukleasen und Restriktionspuffer 34
4.1.12 Oligonukleotide (MWG Biotech AG. Ebersberg) 35
4.1.13 Vektoren 36
4.2 Methoden 38
4.2.1 Präparation von Plasmid DNS 38
4.2.1.1 Midi Präparation von Plasmid DNS durch Bindung an eine Anionen auslauscher Saule
(QiaFilter Midi Kit, QIAGEN®, Hilden) 38
4.2.1.2 Schnellpräparation zur Isolierung von DNS 38
4.2.1.3 Ethanolfällung 39
4.2.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 39
4.2.2.1 Photometrische Bestimmung 39
4.2.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel im Vergleich zu Markerbanden 39
4.2.3 Gelelektrophorese 40
Inhaltsverzeichnis
4.2.4 Isolierung von DNS Fragmenten aus Agarose durch Bindung an Siliziumpartikel
(QIAquick®, Qiagen, Hilden) 40
4.2.5 Enzymatische Reaktionen mit doppelsträngiger DNS 41
4.2.5.1 Spaltung der doppelsträngigen DNS durch Restriktions Endonukleasen 41
4.2.5.2 Ligation von DNS Doppelsträngen mit überlappenden kohäsiven Enden durch T4 DNS
Ligase 41
4.2.6 Bakterienkultur 42
4.2.6.1 Herstellung chemokompetenter E.coli DH5a Bakterien 42
4.2.6.2 Transformation kompetenter E.coli DH5a Bakterien 43
4.2.7 Polymerase Kettenreaktion 43
4.2.8 Plasmid Sequenzierung nach der Kettenabbruch Methode 45
4.2.9 Zellkultur 46
4.2.9.1 Kulturbedingungen 46
4.2.9.2 Ausdünnen adhärenter Zellkulturen 47
4.2.10 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentrifugation 47
4.2.11 Transfektion von Zellen der Linien 293T und Phönix 48
4.2.11.1 Transfektion mit Hilfe von PolyFect®Transfection Reagent, QIAGEN® GmbH, Hilden 48
4.2.11.2 Lipofektion mit Hilfe von Lipofectamin 2000* Reagent, Invitrogen 49
4.2.12 Retrovirale Transduktion peripherer Blutlymphozyten 49
4.2.12.1 Transduktion durch Zellen der Linie 293T 49
4.2.12.2 Transduktion durch Zellen der Linie Phönix 50
4.2.13 Stimulation der anti CEA Rezeptor tragenden T Lymphozyten durch Kokultivierung mit
CEA Antigen positiven Tumorzellen 50
4.2.14 Enzym gekoppelter lmmunadsorbanztest(EUSA) 51
4.2.15 Immunfluoreszenz (FACS) Analysen 52
4.2.15.1 Intrazelluläre IL 12 Detektion: 52
4.2.76 XTT basierenderZytotoxizitätstest 53
4.2.17 Kryokonservierung von Zellen 54
5 ERGEBNISSE 55
5.1 Expression des rekombinanten Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3£ (#700) 55
5.1.1 Expression des Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3 ; (#700) in Zellen der Linie
Phönix. 55
5.1.2 Expression des rekombinanten Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3^ (#700) auf der
Oberfläche humaner Lymphozyten 56
5.2 CEA Expression auf Zellen der Linie LS174T 57
5.3 Spezifische Zytolyse von CEA positiven Tumorzellen durch humane Lymphozyten mit
BW431/26SCFV FC CD3? REZEPTOR (#439) 58
5.4 IL 12 VERSTÄRKT DIE ZYTOLYTISCHE AKTIVITÄT VON LYMPHOZYTEN MIT BW431/26SCFv FC
CD3 Rezeptor (#439) 60
5.5 IL 12 ERHÖHT DIE ANTK3EN SPEZIFISCHE ZYTOLYTISCHE AKTIVITÄT VON HUMANEN CD3+
Lymphozyten mit Immunrezeptor BW431/26scFv Fc CD3 (#439) 61
Inhaltsverzeichnis
5.6 Steigerung der IFN y Sekretion von CD3+ T Zellen mit BW431/26scFv Fc CD3?
Rezeptor (#439) durch Stimulation mit IL 12 63
5.7 Generierung eines bicistronischen Vektors, der für den rekombinanten
Immunrezeptor BW431/26scFv Fc CD3£ und murines scIL 12 kodiert 64
5.8 Expression des rekombinanten Immunrezeptors und des rekombinanten IL 12 durch
DEN BICISTRONISCHEN VEKTOR PMP71 BW431/26SCFv FC CD3? SClL 12 (#921) 69
5.8.1 Expression des bicistronischen Vektors pMP71 BW431/26scFv Fc CD3( sclL 12 (#921) in
humanen Lymphozyten 72
5.9 T Zellen mit dem bicistronischen Vektor pMp71 BW431/26scFv Fc CD3{ scIL 12
(#921) sezernieren rekombinantes il 12 76
5.10 CD8+ T Zellen, die den bicistronischen Vektor pMp71 BW431/26scFv Fc CD3 scIL 12
(#921) exprimieren, haben erhöhte zytolytische aktivität gegenüber cea+
Tumorzellen 77
6 DISKUSSION 81
7 ZUSAMMENFASSUNG 88
8 LITERATURVERZEICHNIS 89
9 ANHANG 97
9.1 Mp71 BW431/26SCFv Fc CD3? SC IL 12(#921) 97
9.1.1 BW431/26scFv Fc CD3Z 97
9.1.2 sc IL 12 99
10 LEBENSLAUF 101
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 13
2 EINLEITUNG 15
2.1 Das kolorektale Karzinom 15
2.2 Das carcinoembryonale Antigen 16
2.3 Die adoptive Immuntherapie 17
2.4 Rekombinante Immunrezeptoren 19
2.5 Synergistische Effekte von rekombinanten Immunrezeptoren und Zytokinen 22
2.6 IL 12 23
2.6.1 Das anti Tumor Potential von IL 12 24
3 ZIELSETZUNG 25
4 MATERIAL UND METHODEN 26
4.1 Material 26
4.1.1 Stammlösungen und Puffer 26
4.1.2 Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese 26
4.1.3 Größenmarker für die Gel Elektrophorese 27
4.1.4 Medien für Bakterienkultur und Medienzusätze 27
4.1.5 Bakterienstämme 28
4.16 Zelllinien 28
4.1.7 Medien für die Zellkultur und Medienzusätze 29
4.1.8 Antikörper und Antiseren 30
4.1.8.1 Primärantikörper 30
4.1.8.2 Konjugierte Sekundärantikörper 31
4.1.9 Antiseren 32
4.1.10 Sonstige Proteine 33
4.1.11 Restriktionsendonukleasen und Restriktionspuffer 34
4.1.12 Oligonukleotide (MWG Biotech AG. Ebersberg) 35
4.1.13 Vektoren 36
4.2 Methoden 38
4.2.1 Präparation von Plasmid DNS 38
4.2.1.1 Midi Präparation von Plasmid DNS durch Bindung an eine Anionen auslauscher Saule
(QiaFilter Midi Kit, QIAGEN®, Hilden) 38
4.2.1.2 Schnellpräparation zur Isolierung von DNS 38
4.2.1.3 Ethanolfällung 39
4.2.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 39
4.2.2.1 Photometrische Bestimmung 39
4.2.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel im Vergleich zu Markerbanden 39
4.2.3 Gelelektrophorese 40
Inhaltsverzeichnis
4.2.4 Isolierung von DNS Fragmenten aus Agarose durch Bindung an Siliziumpartikel
(QIAquick®, Qiagen, Hilden) 40
4.2.5 Enzymatische Reaktionen mit doppelsträngiger DNS 41
4.2.5.1 Spaltung der doppelsträngigen DNS durch Restriktions Endonukleasen 41
4.2.5.2 Ligation von DNS Doppelsträngen mit überlappenden kohäsiven Enden durch T4 DNS
Ligase 41
4.2.6 Bakterienkultur 42
4.2.6.1 Herstellung chemokompetenter E.coli DH5a Bakterien 42
4.2.6.2 Transformation kompetenter E.coli DH5a Bakterien 43
4.2.7 Polymerase Kettenreaktion 43
4.2.8 Plasmid Sequenzierung nach der Kettenabbruch Methode 45
4.2.9 Zellkultur 46
4.2.9.1 Kulturbedingungen 46
4.2.9.2 Ausdünnen adhärenter Zellkulturen 47
4.2.10 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentrifugation 47
4.2.11 Transfektion von Zellen der Linien 293T und Phönix 48
4.2.11.1 Transfektion mit Hilfe von PolyFect®Transfection Reagent, QIAGEN® GmbH, Hilden 48
4.2.11.2 Lipofektion mit Hilfe von Lipofectamin 2000* Reagent, Invitrogen 49
4.2.12 Retrovirale Transduktion peripherer Blutlymphozyten 49
4.2.12.1 Transduktion durch Zellen der Linie 293T 49
4.2.12.2 Transduktion durch Zellen der Linie Phönix 50
4.2.13 Stimulation der anti CEA Rezeptor tragenden T Lymphozyten durch Kokultivierung mit
CEA Antigen positiven Tumorzellen 50
4.2.14 Enzym gekoppelter lmmunadsorbanztest(EUSA) 51
4.2.15 Immunfluoreszenz (FACS) Analysen 52
4.2.15.1 Intrazelluläre IL 12 Detektion: 52
4.2.76 XTT basierenderZytotoxizitätstest 53
4.2.17 Kryokonservierung von Zellen 54
5 ERGEBNISSE 55
5.1 Expression des rekombinanten Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3£ (#700) 55
5.1.1 Expression des Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3 ; (#700) in Zellen der Linie
Phönix. 55
5.1.2 Expression des rekombinanten Immunrezeptors BW431/26scFv Fc CD3^ (#700) auf der
Oberfläche humaner Lymphozyten 56
5.2 CEA Expression auf Zellen der Linie LS174T 57
5.3 Spezifische Zytolyse von CEA positiven Tumorzellen durch humane Lymphozyten mit
BW431/26SCFV FC CD3? REZEPTOR (#439) 58
5.4 IL 12 VERSTÄRKT DIE ZYTOLYTISCHE AKTIVITÄT VON LYMPHOZYTEN MIT BW431/26SCFv FC
CD3 Rezeptor (#439) 60
5.5 IL 12 ERHÖHT DIE ANTK3EN SPEZIFISCHE ZYTOLYTISCHE AKTIVITÄT VON HUMANEN CD3+
Lymphozyten mit Immunrezeptor BW431/26scFv Fc CD3 (#439) 61
Inhaltsverzeichnis
5.6 Steigerung der IFN y Sekretion von CD3+ T Zellen mit BW431/26scFv Fc CD3?
Rezeptor (#439) durch Stimulation mit IL 12 63
5.7 Generierung eines bicistronischen Vektors, der für den rekombinanten
Immunrezeptor BW431/26scFv Fc CD3£ und murines scIL 12 kodiert 64
5.8 Expression des rekombinanten Immunrezeptors und des rekombinanten IL 12 durch
DEN BICISTRONISCHEN VEKTOR PMP71 BW431/26SCFv FC CD3? SClL 12 (#921) 69
5.8.1 Expression des bicistronischen Vektors pMP71 BW431/26scFv Fc CD3( sclL 12 (#921) in
humanen Lymphozyten 72
5.9 T Zellen mit dem bicistronischen Vektor pMp71 BW431/26scFv Fc CD3{ scIL 12
(#921) sezernieren rekombinantes il 12 76
5.10 CD8+ T Zellen, die den bicistronischen Vektor pMp71 BW431/26scFv Fc CD3 scIL 12
(#921) exprimieren, haben erhöhte zytolytische aktivität gegenüber cea+
Tumorzellen 77
6 DISKUSSION 81
7 ZUSAMMENFASSUNG 88
8 LITERATURVERZEICHNIS 89
9 ANHANG 97
9.1 Mp71 BW431/26SCFv Fc CD3? SC IL 12(#921) 97
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