Interaktion von Tumorzellen und hämatopoetischen Zellen im humanen Zervixkarzinom: Regulation der Matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9)
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2006
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|---|---|
| adam_text | I nhaltsverzeich nis
Inhaltsverzeichnis
1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7
2 EINLEITUNG 9
2.1 Zervixkarzinom und humane Papillomviren 9
2.2 Humane Papillomviren 9
2.3 Zytokine und Chemokine im Zervixkarzinom 10
2.4 Interleukin-6 11
2.5 STAT3 12
2.6 Tumor-Stroma-Interaktionen 13
2.7 Dendritische Zellen 13
2.8 Matrixmetalloproteinasen 16
3 ZIELSETZUNG 20
4 MATERIAL 21
4.1 Eukaryotische Zelllinien 21
4.2 Medien und Reagenzien für die Zellkultur 22
4.3 Materialien für die Monozytenisolierung: 23
4.4 Plastikware 23
4.5 Inhibitoren 24
4.6 Zytokine/Wachstumsfaktoren 24
4.7 Sonstige Faktoren 24
4.8 Antikörper 25
4.8.1 Antikörper für ELISA 25
4.8.2 Sekundäre Antikörper 25
4.8.3 Antikörper für Wesiernblols 25
4.8.4 Antikörper für IL-6 Neutralisierung 26
4.8.5 Primäre Antikörper für die Durchflußzytometrie 26
4.8.6 Isotypkontrollen für die Durchflußzytometrie 26
4.8.7 Sekundäre Antikörper für die Durchflußzytometrie 27
4.8.8 Antikörper für Immunhistochemische Färbungen 27
-3-
Inhaltsverzeichnis
Immunhistologie MMP-9/STAT3 27
Immunfluoreszenz MMP-9/STAT3 27
Immunfluoreszenz MMP-9/CD14 27
4.9 Puffer und Lösungen 28
4.10 Radioisotope: 30
4.11 Oligonukleotide 31
4.12 ELISA-Reagenziensysteme 31
4.13 Sonstige Reagenzien/Materialien 32
4.14 Geräte 32
4.15 Proteinstandards 32
4.16 Chemikalien 32
5 METHODEN 33
5.1 Zellkultur 33
5.1.1 Kultivierung der Zelllinien 33
5.1.2 Einfrieren und Langzeitlagerung von Zellen 33
5.1.3 Auftrennung von peripheren Blutmonozyten durch einen Ficoll-Gradienten 33
5.1.4 Magnetische Monozytenseparation von peripheren Blutmonozyten 33
5.1.5 Kultivierung von Monozyten 34
5.1.6 Differenzierung und Reifung von dendritischen Zellen aus Blutmonozyten 34
5.1.7 Durchflußzytometrie 34
5.1.8 Kokultur und Transwellexperiment mit dendritischen Zellen/Fibroblasten 35
5.1.9 Kokultur und Transwellexperiment mit Monozyten 35
5.1.10 Herstellung von Zellüberständen 35
5.1.11 MMP-9 Stimulationsexperiment 35
5.1.12 Inhibitonsexperimente 36
5.1.13 IL-6-Neutralisierungsexperiment 36
5.1.14 Kultivierung von Vorhautkeratinozyten 36
5.1.15 Gewinnung von retroviralen Überständen 36
5.1.16 Retrovirale Infektion von Vorhautkeratinozyten 37
5.2 Proteinmethoden 37
5.2.1 Herstellung von Kernextrakten nach Dignam (Dignam et. al, 1993) 37
5.2.2 Herstellung von Kernextrakten nach Andrews (Andrews et. al, 1991) 37
5.2.3 Herstellung von SDS-Extrakten 38
5.2.4 Westernblot 38
-4-
Inhaltsverzeichnis
5.2.5 Zymogramme 38
5.2.6 ELISA 39
5.2.7 Gelretardierungsanalysen 40
5.2.8 Herstellung radioaktiv markierter Oligonukleotide 40
5.3 DNA-Methoden 40
5.3.1 Standardmethoden 40
5.3.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 40
5.4 Immunhistochemische Untersuchungen 40
6 ERGEBNISSE 43
6.1 Regulation des Chemokins MIP-3a 43
6.2 Die Expression von Gelatinasen im Zervixkarzinom 44
(.3 Zervixkarzinomzellen und Fibroblasten sezernieren auch in Kokultur keine
MMP-9 46
6.4 Expression und Regulation von MMP-9 47
6.4.1 Die MMP-9- und CD14-Expression in zervikalen HPV-positiven intraepithelialen
Neoplasien 47
6.4.2 Kokultivierung von (prä-)neoplastischen Zellen und Monozyten führt zur pro-MMP-9-
Expression 50
6.4.3 (prä-)neoplastische Zellen induzieren pro-MMP-9-Expression in Monozyten auch ohne
direkten Zeil-Kontakt 51
6.4.4 Kokultur von (prä-)neoplastische Zellen und iDC führt zur pro-MMP-9 Induktion 53
6.4.5 MMP-9 wird in iDC durch Transwellkultur mit (prä-)neoplastischen Zellen induziert.53
6.4.6 Lösliche Faktoren (prä-)neoplastischer Zellen induzieren pro-MMP-9 in Monozyten und
unreifen dendritischen Zellen 55
6.4.7 MMP-9- und STAT3 Expression in hochgradigen intraepithelialen Neoplasien 56
6.4.8 Überstände (prä-)neoplastischer Zellen aktivieren STAT3 in Monozyten 59
6.4.9 Die STAT3-Aktivierung in Monozyten erfolgt über die JAK2 60
6.4.10 STAT3-Aktivierung erfolgt auch in iDC über JAK 63
6.4.11 Die durch (prä)-neoplastische Zellüberstände induzierte pro-MMP-9-Expression wird
durch den JAK-STAT3 -Signalweg vermittelt 64
6.4.12 Expression verschiedener Faktoren durch Zervixkarzinomzellen 65
6.4.13 IL-6-Stimulation führt zur MMP-9-Expression in iDC 66
6.4.14 Die Neutralisierung von IL-6 unterdrückt die von SW756-ZeIlen induzierte pro-
MMP-9-Expression in iDC 67
-5-
Inhaltsverzeichnis
6.5 Parakrine Wirkung von (prä-)neoplastischen Zellen auf dendritische Zellen 69
6.5.1 (Prä-)neoplastische Zellüberstände verändern die Morphologie unreifer dendritischer
Zellen 69
6.5.2 (Prä-)neoplastische Zellüberstände verändern reife dendritische Zellen morphologisch,
aber nicht die Expression von Oberflächenmarkern 71
6.5.3 Zervixkarzinomzell-Überstände reprimieren die LPS-induzierte Hochregulation von
CCR7 73
7 DISKUSSION 74
7.1 Regulation der MIP-3a-Expression durch HPV 74
7.2 Expression und Regulation der Gelatinase MMP-9 76
8 ZUSAMMENFASSUNG 82
9 ABSTRACT 84
10 LITERATURVERZEICHNIS 85
-6-
|
| adam_txt |
I nhaltsverzeich nis
Inhaltsverzeichnis
1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7
2 EINLEITUNG 9
2.1 Zervixkarzinom und humane Papillomviren 9
2.2 Humane Papillomviren 9
2.3 Zytokine und Chemokine im Zervixkarzinom 10
2.4 Interleukin-6 11
2.5 STAT3 12
2.6 Tumor-Stroma-Interaktionen 13
2.7 Dendritische Zellen 13
2.8 Matrixmetalloproteinasen 16
3 ZIELSETZUNG 20
4 MATERIAL 21
4.1 Eukaryotische Zelllinien 21
4.2 Medien und Reagenzien für die Zellkultur 22
4.3 Materialien für die Monozytenisolierung: 23
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4.5 Inhibitoren 24
4.6 Zytokine/Wachstumsfaktoren 24
4.7 Sonstige Faktoren 24
4.8 Antikörper 25
4.8.1 Antikörper für ELISA 25
4.8.2 Sekundäre Antikörper 25
4.8.3 Antikörper für Wesiernblols 25
4.8.4 Antikörper für IL-6 Neutralisierung 26
4.8.5 Primäre Antikörper für die Durchflußzytometrie 26
4.8.6 Isotypkontrollen für die Durchflußzytometrie 26
4.8.7 Sekundäre Antikörper für die Durchflußzytometrie 27
4.8.8 Antikörper für Immunhistochemische Färbungen 27
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Inhaltsverzeichnis
Immunhistologie MMP-9/STAT3 27
Immunfluoreszenz MMP-9/STAT3 27
Immunfluoreszenz MMP-9/CD14 27
4.9 Puffer und Lösungen 28
4.10 Radioisotope: 30
4.11 Oligonukleotide 31
4.12 ELISA-Reagenziensysteme 31
4.13 Sonstige Reagenzien/Materialien 32
4.14 Geräte 32
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4.16 Chemikalien 32
5 METHODEN 33
5.1 Zellkultur 33
5.1.1 Kultivierung der Zelllinien 33
5.1.2 Einfrieren und Langzeitlagerung von Zellen 33
5.1.3 Auftrennung von peripheren Blutmonozyten durch einen Ficoll-Gradienten 33
5.1.4 Magnetische Monozytenseparation von peripheren Blutmonozyten 33
5.1.5 Kultivierung von Monozyten 34
5.1.6 Differenzierung und Reifung von dendritischen Zellen aus Blutmonozyten 34
5.1.7 Durchflußzytometrie 34
5.1.8 Kokultur und Transwellexperiment mit dendritischen Zellen/Fibroblasten 35
5.1.9 Kokultur und Transwellexperiment mit Monozyten 35
5.1.10 Herstellung von Zellüberständen 35
5.1.11 MMP-9 Stimulationsexperiment 35
5.1.12 Inhibitonsexperimente 36
5.1.13 IL-6-Neutralisierungsexperiment 36
5.1.14 Kultivierung von Vorhautkeratinozyten 36
5.1.15 Gewinnung von retroviralen Überständen 36
5.1.16 Retrovirale Infektion von Vorhautkeratinozyten 37
5.2 Proteinmethoden 37
5.2.1 Herstellung von Kernextrakten nach Dignam (Dignam et. al, 1993) 37
5.2.2 Herstellung von Kernextrakten nach Andrews (Andrews et. al, 1991) 37
5.2.3 Herstellung von SDS-Extrakten 38
5.2.4 Westernblot 38
-4-
Inhaltsverzeichnis
5.2.5 Zymogramme 38
5.2.6 ELISA 39
5.2.7 Gelretardierungsanalysen 40
5.2.8 Herstellung radioaktiv markierter Oligonukleotide 40
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5.4 Immunhistochemische Untersuchungen 40
6 ERGEBNISSE 43
6.1 Regulation des Chemokins MIP-3a 43
6.2 Die Expression von Gelatinasen im Zervixkarzinom 44
(.3 Zervixkarzinomzellen und Fibroblasten sezernieren auch in Kokultur keine
MMP-9 46
6.4 Expression und Regulation von MMP-9 47
6.4.1 Die MMP-9- und CD14-Expression in zervikalen HPV-positiven intraepithelialen
Neoplasien 47
6.4.2 Kokultivierung von (prä-)neoplastischen Zellen und Monozyten führt zur pro-MMP-9-
Expression 50
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6.4.4 Kokultur von (prä-)neoplastische Zellen und iDC führt zur pro-MMP-9 Induktion 53
6.4.5 MMP-9 wird in iDC durch Transwellkultur mit (prä-)neoplastischen Zellen induziert.53
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unreifen dendritischen Zellen 55
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6.4.9 Die STAT3-Aktivierung in Monozyten erfolgt über die JAK2 60
6.4.10 STAT3-Aktivierung erfolgt auch in iDC über JAK 63
6.4.11 Die durch (prä)-neoplastische Zellüberstände induzierte pro-MMP-9-Expression wird
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6.4.14 Die Neutralisierung von IL-6 unterdrückt die von SW756-ZeIlen induzierte pro-
MMP-9-Expression in iDC 67
-5-
Inhaltsverzeichnis
6.5 Parakrine Wirkung von (prä-)neoplastischen Zellen auf dendritische Zellen 69
6.5.1 (Prä-)neoplastische Zellüberstände verändern die Morphologie unreifer dendritischer
Zellen 69
6.5.2 (Prä-)neoplastische Zellüberstände verändern reife dendritische Zellen morphologisch,
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7.1 Regulation der MIP-3a-Expression durch HPV 74
7.2 Expression und Regulation der Gelatinase MMP-9 76
8 ZUSAMMENFASSUNG 82
9 ABSTRACT 84
10 LITERATURVERZEICHNIS 85
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