Generierung der Kinasekinase alpha Knockout-Maus:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 5
1 Einleitung 6
1.1 Intrazelluläre Signaltransduktion Kalzium als Second Messenger 6
1.2 Das Netzwerk der Kalzium/Calmodulin abhängigen Proteinkinasen 9
1.2.1 Die Familie Kalzium/Calmodulin abhängiger Proteinkinasen 9
1.2.2 Die Kinasekinasen alpha und beta 13
1.2.2.1 Genomische Organisation 14
1.2.2.2 Expression und Regulation 14
1.2.2.3 Substrate und Funktionen 15
1.3 Ziele, Strategien und Probleme transgener Mausmodelle 16
1.3.1 Ziele 16
1.3.2 Targetingstrategien 17
1.3.3 Screeningstrategien 18
1.3.4 Probleme 18
1.4 Aufgabenstellung 19
2 Materialien und Methoden 20
2.1 Methodisches Vorgehen 20
2.2 Versuchstiere 22
2.3 Die Prozeduren im Einzelnen 23
2.3.1 Bakterienkultur 23
2.3.1.1 Herstellung von Nährmedien und Agarplatten 24
2.3.1.2 Bakterienkultur 24
2.3.1.3 Präparation kompetenter Bakterien 24
2.3.1.4 Bakterientransformation 25
2.3.2 DNA Manipulation 25
2.3.2.1 DNA Isolierung aus Bakterien 27
2.3.2.2 DNA Isolierung aus ES Zellen 28
2.3.2.3 DNA Isolierung aus Gewebe 29
2.3.2.4 Restriktionsreaktion 29
2.3.2.5 Elektrophoretrische Auftrennung im Agarosegel 30
2.3.2.6 Southern Blot und Probing 30
2.3.2.7 Bandenisolierung und DNA Aufreinigung aus Agarosegel 32
2.3.2.8 Ligationsreaktion 32
2.3.2.9 Phenol / Chloroform Extraktion 33
3
2.3.3 PCR 33
2.3.4 DNA Sequenzierung 35
2.3.5 Primer Extensionsanalyse 37
2.3.6 Transfektion und Kultur von embryonalen Stammzellen 38
2.3.7 Injektion in Blastozysten und Implantation in Foundermäuse 41
2.3.8 RNA Isolierung, Reverse Transkription und Northern Blot 41
2.3.9 Proteingewinnung und Western Blott 43
2.3.9.1 Proteinextraktion 45
2.3.9.2 Proteinkonzentrationsassay 45
2.3.9.3 Proteinelektrophorese 45
2.3.9.4 Membranblotting 46
2.3.9.5 Proteinnachweis 46
3 Ergebnisse 48
3.1 Die cDNA der Ratte 48
3.2 Northernblot Untersuchung zum Expressionsmuster der murinen CaMkinasekinase alpha 49
3.3 Klonierung genomischer DNA und Restriktionsverdau 50
3.4 Sequenzierung der Exon / Introngrenzen: Genomische Organisation der K.K alpha 54
3.5 Design des Constructs 60
3.6 Ergebnis der Stammzelltransfektion 62
3.7 Chimärenzüchtung / Die Mutation geht „germline . 62
3.8 Expression der KK alpha im transgenen Mausmodell 63
4 Diskussion 65
4.1 Die genomische Organisation des murinen CaMkinasekinase alpha Gens 65
4.2 Methodenkritik des Mausmodells mit selektiver Inaktivierung der CaMkinasekinase alpha 67
4.3 Signaltransduktion mittels multifunktionaler CaMkinasen Bedeutung des Mausmodells 72
5 Zusammenfassung 77
6 Literaturverzeichnis 79
7 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 91
8 Lebenslauf 92
9 Publikationen 93
10 Danksagung 94
4
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 5
1 Einleitung 6
1.1 Intrazelluläre Signaltransduktion Kalzium als Second Messenger 6
1.2 Das Netzwerk der Kalzium/Calmodulin abhängigen Proteinkinasen 9
1.2.1 Die Familie Kalzium/Calmodulin abhängiger Proteinkinasen 9
1.2.2 Die Kinasekinasen alpha und beta 13
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1.2.2.2 Expression und Regulation 14
1.2.2.3 Substrate und Funktionen 15
1.3 Ziele, Strategien und Probleme transgener Mausmodelle 16
1.3.1 Ziele 16
1.3.2 Targetingstrategien 17
1.3.3 Screeningstrategien 18
1.3.4 Probleme 18
1.4 Aufgabenstellung 19
2 Materialien und Methoden 20
2.1 Methodisches Vorgehen 20
2.2 Versuchstiere 22
2.3 Die Prozeduren im Einzelnen 23
2.3.1 Bakterienkultur 23
2.3.1.1 Herstellung von Nährmedien und Agarplatten 24
2.3.1.2 Bakterienkultur 24
2.3.1.3 Präparation kompetenter Bakterien 24
2.3.1.4 Bakterientransformation 25
2.3.2 DNA Manipulation 25
2.3.2.1 DNA Isolierung aus Bakterien 27
2.3.2.2 DNA Isolierung aus ES Zellen 28
2.3.2.3 DNA Isolierung aus Gewebe 29
2.3.2.4 Restriktionsreaktion 29
2.3.2.5 Elektrophoretrische Auftrennung im Agarosegel 30
2.3.2.6 Southern Blot und Probing 30
2.3.2.7 Bandenisolierung und DNA Aufreinigung aus Agarosegel 32
2.3.2.8 Ligationsreaktion 32
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2.3.4 DNA Sequenzierung 35
2.3.5 Primer Extensionsanalyse 37
2.3.6 Transfektion und Kultur von embryonalen Stammzellen 38
2.3.7 Injektion in Blastozysten und Implantation in Foundermäuse 41
2.3.8 RNA Isolierung, Reverse Transkription und Northern Blot 41
2.3.9 Proteingewinnung und Western Blott 43
2.3.9.1 Proteinextraktion 45
2.3.9.2 Proteinkonzentrationsassay 45
2.3.9.3 Proteinelektrophorese 45
2.3.9.4 Membranblotting 46
2.3.9.5 Proteinnachweis 46
3 Ergebnisse 48
3.1 Die cDNA der Ratte 48
3.2 Northernblot Untersuchung zum Expressionsmuster der murinen CaMkinasekinase alpha 49
3.3 Klonierung genomischer DNA und Restriktionsverdau 50
3.4 Sequenzierung der Exon / Introngrenzen: Genomische Organisation der K.K alpha 54
3.5 Design des Constructs 60
3.6 Ergebnis der Stammzelltransfektion 62
3.7 Chimärenzüchtung / Die Mutation geht „germline". 62
3.8 Expression der KK alpha im transgenen Mausmodell 63
4 Diskussion 65
4.1 Die genomische Organisation des murinen CaMkinasekinase alpha Gens 65
4.2 Methodenkritik des Mausmodells mit selektiver Inaktivierung der CaMkinasekinase alpha 67
4.3 Signaltransduktion mittels multifunktionaler CaMkinasen Bedeutung des Mausmodells 72
5 Zusammenfassung 77
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