Genexpressionsanalysen von malignen Melanomen und zugehörigen primären Zelllinien:
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|---|---|
| adam_text | I. Einleitung 3
1. Das maligne Melanom 3
1.1. Definition und Allgemeines 3
1.2. Inzidenz 3
1.3. Ätiopathogenese 3
1.4. Klinisches Bild und Melanomtypen 4
1.5. Diagnostik 6
1.6. Therapie des Primärtumors 7
1.7. Stadieneinteilung (Staging und Prognose) 7
1.8. Adjuvante Therapie im tumorfreien Stadium 9
1.9. Therapie bei Tumorprogression und Metastasierung 10
2. Experimentelle Immuntherapie und Vakzinierung 12
2.1.Ganz-Zell-Vakzinierung 14
2.2. Peptidvakzinierung 14
2.3. Vakzinierung mit dendritischen Zellen 15
2.4. Hitze-Schock-Proteine (HSP) 15
2.5. Gentransfer 16
2.6. Gangliosid-Vakzinierung (B-Zell-vermittelt) 16
2.7. Anti-Idiotyp-Vakzinierung 16
2.8. Immunisierung mit DNA 16
2.9. Adoptive Immuntherapie 17
3. Array-Technologie und Vakzinierung 17
4. Zielsetzung der Arbeit 19
II. Material und Methoden 20
1. Verwendetes Tumormaterial 20
2. Zellkulturen 20
2.1. Primärkultur 21
2.2. Zellkultivierung und Zellanzucht 22
2.3. Kultivierung von Einzelzellklonen 23
3. RNA-Isolierung 23
3.1. RNA-Isolierung aus Melanommetastasen 24
3.2. RNA-Isolierung aus Zellkulturzellen 24
3.3. Extraktion 24
3.4.DNAse-I-Behandlung 25
3.5. mRNA-Isolierung 25
3.6. Quantifizierung der RNA 26
4. Array-/Chip-Hybridisierungen 26
4.1.Incyte-Array-Hybridisierungen 26
4.2. Glas-Chip-Hybridisierungen 30
5. Auswertung des Incyte-Arrays 30
5.1. Auflegen des Grids 31
5.2. Festlegung des „Threshold (Bewertungsgrenze der Signalintensität) 31
5.3. Fehlerkontrolle der Software 32
5.4. Subtraktion des Background 32
5.5. Normalisierung 32
5.6. Auswertung der Genexpressionsänderungen innerhalb eines Falles mit AIDA
Array Compare® 32
5.7. Auswertung der Genexpressionsänderung als Cluster Analysis 37
6. Validierung der Array-Ergebnisse mittels RT-PCR 40
III. Ergebnisse 42
1. Vorexperimente 42
2. Genexpressionsänderungen der Melanommetastasen in Zellkultur 44
2.1. Genexpressionsänderungen innerhalb eines Falles (mit AIDA Array Compare®) 44
2.2. Cluster-Analyse der Melanommetastasen-Zelllinien mit J-Express® 48
3. Profil der Genexpressionsanalyse von Melanom-Zelllinien aus Einzelzellklonen 50
4. Validierung der Genexpressionsänderungen mit TaqMan RT-PCR 51
IV. Diskussion 53
V. Zusammenfassung 59
VI. Literatur 61
VII. Anhang 66
1. Abkürzungen 66
2. Veröffentlichung und Poster 67
3. Lebenslauf 72
4. Danksagung 73
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I. Einleitung 3
1. Das maligne Melanom 3
1.1. Definition und Allgemeines 3
1.2. Inzidenz 3
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1.4. Klinisches Bild und Melanomtypen 4
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1.6. Therapie des Primärtumors 7
1.7. Stadieneinteilung (Staging und Prognose) 7
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1.9. Therapie bei Tumorprogression und Metastasierung 10
2. Experimentelle Immuntherapie und Vakzinierung 12
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2.9. Adoptive Immuntherapie 17
3. Array-Technologie und Vakzinierung 17
4. Zielsetzung der Arbeit 19
II. Material und Methoden 20
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2.3. Kultivierung von Einzelzellklonen 23
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3.1. RNA-Isolierung aus Melanommetastasen 24
3.2. RNA-Isolierung aus Zellkulturzellen 24
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5.3. Fehlerkontrolle der Software 32
5.4. Subtraktion des Background 32
5.5. Normalisierung 32
5.6. Auswertung der Genexpressionsänderungen innerhalb eines Falles mit AIDA
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5.7. Auswertung der Genexpressionsänderung als Cluster Analysis 37
6. Validierung der Array-Ergebnisse mittels RT-PCR 40
III. Ergebnisse 42
1. Vorexperimente 42
2. Genexpressionsänderungen der Melanommetastasen in Zellkultur 44
2.1. Genexpressionsänderungen innerhalb eines Falles (mit AIDA Array Compare®) 44
2.2. Cluster-Analyse der Melanommetastasen-Zelllinien mit J-Express® 48
3. Profil der Genexpressionsanalyse von Melanom-Zelllinien aus Einzelzellklonen 50
4. Validierung der Genexpressionsänderungen mit TaqMan RT-PCR 51
IV. Diskussion 53
V. Zusammenfassung 59
VI. Literatur 61
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