Stamm-Typisierung von Sproßpilzisolaten der Spezies Candida albicans von Patienten mit HIV-Infektion mittels Ca (Candida albicans) 3-DNA-Fingerprinting:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Bibliographische Beschreibung 2
Inhaltsverzeichnis 3
1. Abkürzungsverzeichnis 6
2. Einführung 8
2.1 Einteilung der Pilze 8
2.2 SPROßPILZE 9
2.2.1 Bedeutung der Sproßpilze in der Medizin 9
2.2.2 Diagnostik von Sproßpilzinfektionen 12
2.2.2.1 Klinik 12
2.2.2.2 Mikrobiologische Diagnostik 12
2.2.2.2.1 Mikroskopie 12
2.2.2.2.2 Kultur 13
2.2.3 Differenzierung von Sproßpilzen bis zur Speziesebene 13
2.2.3.1 Makromorphologische Sproßpilzdifferenzierung 13
2.2.3.2 Mikromorphologische Sproßpilzdifferenzierung 14
2.2.3.3 Biochemische Diagnostik zur Speziesdifferenzierung
von Sproßpilzen 14
2.2.3.3.1 Allgemeines 14
2.2.3.3.2 Cycloheximidresistenz 15
2.2.3.3.3 Schnelldiagnostik 15
2.2.3.3.4 Biochemische Differenzierung 15
2.3 Typisierung von Ond/oa-Arten auf Stammebene 16
2.3.1 Serotypisierung 16
2.3.2 Typisierung anhand des Enzymmusters: Lipase- und
Proteinaseaktivität 16
2.3.3 Morphologische Typisierung 17
2.3.4 Typisierung anhand von Resistenzen 17
2.3.5 Typisierung mit Hilfe von Killerhefen 17
2.3.6 Lektinagglutination 18
2.3.7 Komplexes Biotypisierungsverfahren nach Odds und Abbott 18
2.3.8 Karyotypisierung mittels Restriktionsfragmentlängenpolyrnorphismus 19
3
2.3.9 DNA-Fingerprinting 20
2.4 HIV UND CANDIDA ALBICANS 22
2.4.1 C.albicans-Infektionen bei HIV-Patienten 22
2.4.2 Die CDC-Klassifikation 22
2.4.2.1 Die Laborkategorien 1 bis 3 22
2.4.2.2 Die klinischen Kategorien A bis C 23
3. Aufgabenstellung 26
4. Methode und Material 27
4.1 Kultivierung der C. albicans- solate 27
4.1.1 Herkunft der Isolate 27
4.1.2 Anzucht der C. a/6/cans-lsolate 28
4.1.3 Schüttelkulturen 28
4.1.4 Separierung der Sproßpilzsuspensionen 28
4.2 DNA-Isolation 28
4.2.1 Protoblastenherstellung und Lyse 28
4.2.2 DNA-Extraktion und -Fällung 29
4.3 Ca3-DNA-Fingerprint 30
4.3.1 DNA-Fragmentierung mit EcoRI 30
4.3.2 DNA-Agarosegel-Elektrophorese 30
4.3.3 Transfer (Southern Blotting) mittels Vakuum 30
4.3.4 Markierung der Ca3-Sequenz 31
4.3.5 Hybridisierung 31
4.3.6 Waschen 32
4.3.7 Enzym-Immunoassay zum Nachweis hybridisierter
Ca3-DNA-Sequenzen 32
4.3.8 Auswertung der Southern-Blots 33
4.4 Material 35
4.4.1 Sabouraud 4%-Glukose-Agar pH 6,9 35
4.4.2 Sabouraud-Nährmedium 35
4.4.3 Lösungen zur Protoblastenherstellung und Lyse 35
4.4.4 Lösungen zur DNA-Extraktion 36
4.4.5 Material und Lösungen Elektrophorese (der ungeschnittenen DNA) 36
4.4.6 Lösungen und Geräte für den DNA-Verdau 37
4.4.7 Elektrophorese 37
4
4.4.8 Lösungen und Material für das „vacuum blotting 37
4.4.9 Material für die Hybridisierung 38
4.4.10 Waschlösungen nach der Hybridisierung 40
4.4.11 Lösungen für den immunologischen Nachweis 40
4.4.12 Software 41
4.4.13 Sonstige Materialien 41
5. Ergebnisse 42
5.1 Quantität und Qualität der extrahierten DNA 42
5.2 Restriktionsverdauanalyse 44
5.3 Markierung und Analyse der Sonde 45
5.4 southernblot und hybridisierung 46
5.5 Auswertung der DNA-Fingerprints 47
6. Diskussion 53
6.1 Die Methode der Stammtypisierung von C. albicans 53
6.2 Die Untersuchung der Isolate von HIV-Patienten 55
7. Zusammenfassung 61
8. Literatur 64
9. Eigenständigkeitserklärung 74
10. Danksagung 75
11. Lebenslauf 76
12. Anhang 78
5
|
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Inhaltsverzeichnis
Bibliographische Beschreibung 2
Inhaltsverzeichnis 3
1. Abkürzungsverzeichnis 6
2. Einführung 8
2.1 Einteilung der Pilze 8
2.2 SPROßPILZE 9
2.2.1 Bedeutung der Sproßpilze in der Medizin 9
2.2.2 Diagnostik von Sproßpilzinfektionen 12
2.2.2.1 Klinik 12
2.2.2.2 Mikrobiologische Diagnostik 12
2.2.2.2.1 Mikroskopie 12
2.2.2.2.2 Kultur 13
2.2.3 Differenzierung von Sproßpilzen bis zur Speziesebene 13
2.2.3.1 Makromorphologische Sproßpilzdifferenzierung 13
2.2.3.2 Mikromorphologische Sproßpilzdifferenzierung 14
2.2.3.3 Biochemische Diagnostik zur Speziesdifferenzierung
von Sproßpilzen 14
2.2.3.3.1 Allgemeines 14
2.2.3.3.2 Cycloheximidresistenz 15
2.2.3.3.3 Schnelldiagnostik 15
2.2.3.3.4 Biochemische Differenzierung 15
2.3 Typisierung von Ond/oa-Arten auf Stammebene 16
2.3.1 Serotypisierung 16
2.3.2 Typisierung anhand des Enzymmusters: Lipase- und
Proteinaseaktivität 16
2.3.3 Morphologische Typisierung 17
2.3.4 Typisierung anhand von Resistenzen 17
2.3.5 Typisierung mit Hilfe von Killerhefen 17
2.3.6 Lektinagglutination 18
2.3.7 Komplexes Biotypisierungsverfahren nach Odds und Abbott 18
2.3.8 Karyotypisierung mittels Restriktionsfragmentlängenpolyrnorphismus 19
3
2.3.9 DNA-Fingerprinting 20
2.4 HIV UND CANDIDA ALBICANS 22
2.4.1 C.albicans-Infektionen bei HIV-Patienten 22
2.4.2 Die CDC-Klassifikation 22
2.4.2.1 Die Laborkategorien 1 bis 3 22
2.4.2.2 Die klinischen Kategorien A bis C 23
3. Aufgabenstellung 26
4. Methode und Material 27
4.1 Kultivierung der C. albicans-\solate 27
4.1.1 Herkunft der Isolate 27
4.1.2 Anzucht der C. a/6/cans-lsolate 28
4.1.3 Schüttelkulturen 28
4.1.4 Separierung der Sproßpilzsuspensionen 28
4.2 DNA-Isolation 28
4.2.1 Protoblastenherstellung und Lyse 28
4.2.2 DNA-Extraktion und -Fällung 29
4.3 Ca3-DNA-Fingerprint 30
4.3.1 DNA-Fragmentierung mit EcoRI 30
4.3.2 DNA-Agarosegel-Elektrophorese 30
4.3.3 Transfer (Southern Blotting) mittels Vakuum 30
4.3.4 Markierung der Ca3-Sequenz 31
4.3.5 Hybridisierung 31
4.3.6 Waschen 32
4.3.7 Enzym-Immunoassay zum Nachweis hybridisierter
Ca3-DNA-Sequenzen 32
4.3.8 Auswertung der Southern-Blots 33
4.4 Material 35
4.4.1 Sabouraud 4%-Glukose-Agar pH 6,9 35
4.4.2 Sabouraud-Nährmedium 35
4.4.3 Lösungen zur Protoblastenherstellung und Lyse 35
4.4.4 Lösungen zur DNA-Extraktion 36
4.4.5 Material und Lösungen Elektrophorese (der ungeschnittenen DNA) 36
4.4.6 Lösungen und Geräte für den DNA-Verdau 37
4.4.7 Elektrophorese 37
4
4.4.8 Lösungen und Material für das „vacuum blotting" 37
4.4.9 Material für die Hybridisierung 38
4.4.10 Waschlösungen nach der Hybridisierung 40
4.4.11 Lösungen für den immunologischen Nachweis 40
4.4.12 Software 41
4.4.13 Sonstige Materialien 41
5. Ergebnisse 42
5.1 Quantität und Qualität der extrahierten DNA 42
5.2 Restriktionsverdauanalyse 44
5.3 Markierung und Analyse der Sonde 45
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5.5 Auswertung der DNA-Fingerprints 47
6. Diskussion 53
6.1 Die Methode der Stammtypisierung von C. albicans 53
6.2 Die Untersuchung der Isolate von HIV-Patienten 55
7. Zusammenfassung 61
8. Literatur 64
9. Eigenständigkeitserklärung 74
10. Danksagung 75
11. Lebenslauf 76
12. Anhang 78
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