Modulation der T-Zellfunktion durch flüchtige aromatische Verbindungen:
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|---|---|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung_______________________________________________________1
1.1. Pathophysiologische Mechanismen der Allergie.______________________1
1.2. Bedeutung der Innenraumluft. 4
1.3. Einfluss der Innenraumluft_______________________________________5
1.3.1. Physikalische Eigenschaften der Innenraumluft_______________________5
1.3.2. Biologische Bestandteile der Innenraumluft . _.6
1.3.3. Chemische Bestandteile der Innenraumluft__________________________7
1.4. VOCs_______________________________________________________9
1.4.1. Naphthalin................................................................................................................................................................ . 9
1.4.2. Chlorbenzol, Styrol, Toluol und Xylol 10
1.5. Allergieregulation des Immunsystems_____________________________12
1.6. Zielstellung_________________________________________________13
2. Material und Methoden___________........_____ ________ ___ __........... _____14
2.1. Materialien und Geräte___.............__....._................._ „ ___......_......_...........................__ __.............___14
2.1.1. Chemikalien, Lösungen und Puffer_______________________________14
2.1.1.1. Chemikalien allgemein........................................................................................................... .__ 14
2.1.1.2. Untersuchte Chemikalien 14
2.1.1.3. Lösungen, Puffer und Zellkulturreagenzien_________________________15
2.1.2. Immunreagenzien und Proteine__________________________________15
2.1.2.1. Immunreagenzien für die ELISA-Systeme 15
2.1.2.2. Immunreagenzien für die Zellstimulation ___________................. ___........._ _.16
2.1.3.1. Verbrauchsmaterialien_________________________________________16
2.1.3.2. Geräte_________________________________________________.....___16
2.1.3.3. Software _____________________......_________......__......._.._..................„__............._17
2.2. Methoden___________________________________________________17
2.2.1. Präparation mononukleärer Zellen _ .„17
2.2.2. Durchführung der Zellkultur.__. ___ ____ _ _17
2.2.3. Durchführung der Immunmodulationsversuche______________________20
2.2.3.1. Vorbereitung und Applikation der Proben__________________________ 21
2.2.3.2. Durchführung und Messung der ELISA- Systeme 22
2.2.3.2.1. Prinzip der Methode_________________________________________22
2.2.3.2.2. Beschichtung der ELISA- Platten_______________________-23
IV
2.2.3.2.3. Erstellung und Auftragung der Standard-Verdünnungsreihe 24
2.2.3.2.4. Auftragung der Kulturüberstände________________________________24
2.2.3.2.5. Herstellung und Auftragung der biotinylierten Detektions-Antikörper_____24
2.2.3.2.6. Anwendung der Substratpuffer im ELISA „__.........___......._ _..............._....._............_ 25
2.2.3.2.7. Messung und Auswertung der ELISA-Systeme______________________25
2.2.3.3. MTT-Test__________________________________________________25
2.2.3.3.1. Prinzip der Methode._________________________________________25
2.2.3.3.2. Durchführung des MTT-Tests_________________________.......________25
2.2.3.4. Nachweis der m-RNA Expression von Zytokinen mittels real-Time PCR__26
2.2.3.4.1. mRNA-Präparation___________________________________________26
2.2.3.4.2. cDNA-Synthese..........................................____........................................._...........__._........_..........„........................................._......._..................„27
2.2.3.4.3. Real-Time PCR_____________________________________________28
2.2.3.4.3.1. Prinzip der Methode__________________________________________28
2.2.3.4.3.2. Vorbereitung der PCR __ _ ___ _................_........______.........................____......................28
2.2.3.4.3.3. Durchführung der PCR________________________________________29
2.2.4. Statistische Auswertung_______________________________________30
3. Ergebnisse_____________________________________________________30
3.1. In vitro Modell zur Bestimmung immunmodulatorischer Effekte________30
3.1.1. Zellproliferation nach ahCD3/ ahCD28- Stimulation._________________31
3.1.2. Zytokinproduktion nach ahCD3/ ahCD28- Stimulation________________31
3.1.3. Einfluss der verwendeten Lösungsmittel DMSO und Methanol
auf die Proliferation/ Vitalität___________________________________33
3.1.4. Einfluss der verwendeten Lösungsmittel DMSO und
Methanol auf Zytokinproduktion__.......__ __ __.........................................__________33
3.2. Effekte von VOCs auf Vitalität und funktioneile Aktivität von PBMC____35
3.2.1. Chlorbenzol________________________________________________35
3.2.1.1. Einfluss von Chlorbenzol auf Vitalität der Zellen____________________35
3.2.1.2. Einfluss von Chlorbenzol auf die Zytokinproduktion_________________36
3.2.2. Styrol_____________________________________________________38
3.2.2.1. Einfluss von Styrol auf die Vitalität der Zellen _________________38
3.2.2.2. Einfluss von Styrol auf die Zytokinproduktion__ _____ _________40
3.2.3. Toluol....._____.........____.....___________........_______________.......____........„..............40
3.2.3.1. Einfluss von Toluol auf Vitalität der Zellen_________________________40
3.2.3.2. Einfluss von Toluol auf die Zytokinproduktion______________________41
3.2.4. Xylol............................................_.................................................................._..............................................................................................................................................................................43
3.2.4.1. Einfluss von Xylol auf Vitalität der Zellen__________________________43
3.2.4.2. Einfluss von Xylol auf die Zytokinproduktion_______________________45
3.2.5. Naphthalin............................................_..............._..........................................._...................................................................................................................................................45
3.2.5.1. Einfluss von Naphthalin auf Vitalität der Zellen___________ _______ _45
3.2.5.2. Einfluss von Naphthalin auf die Zytokinproduktion___________________46
3.2.5.3. PCR- Messergebnisse der Naphthalinversuchsansätze____......__i_________48
4. Diskussion_________________........___________________.....___....._________.......__52
4.1.1. In vitro Modell zur Untersuchung immunmodulierender Effekte von VOC_52
4.1.2. Einfluss der verwendeten Lösungsmittel__________________________53
4.2. ChlorbenzoL......................................................................................._...................................................................................................................................__........................54
4.3. Styrol______________________________________________________56
4.4. Toluol_____________________________________________________57
4.5. m-XyloL.............._................................................................................................................................................................................................................_..............................._59
4.6. Naphthalin_______......._____________......_______.........._.............................___.........____ __60
5. Zusammenfassung der Arbeit_______________________________________64
Anhang,____________________________________________________________i-xii
|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung_1
1.1. Pathophysiologische Mechanismen der Allergie._1
1.2. Bedeutung der Innenraumluft. 4
1.3. Einfluss der Innenraumluft_5
1.3.1. Physikalische Eigenschaften der Innenraumluft_5
1.3.2. Biologische Bestandteile der Innenraumluft . _.6
1.3.3. Chemische Bestandteile der Innenraumluft_7
1.4. VOCs_9
1.4.1. Naphthalin. . 9
1.4.2. Chlorbenzol, Styrol, Toluol und Xylol 10
1.5. Allergieregulation des Immunsystems_12
1.6. Zielstellung_13
2. Material und Methoden_._ _ _ _. _14
2.1. Materialien und Geräte_._._._ „ _._._._ _._14
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2.1.1.1. Chemikalien allgemein. ._ 14
2.1.1.2. Untersuchte Chemikalien 14
2.1.1.3. Lösungen, Puffer und Zellkulturreagenzien_15
2.1.2. Immunreagenzien und Proteine_15
2.1.2.1. Immunreagenzien für die ELISA-Systeme 15
2.1.2.2. Immunreagenzien für die Zellstimulation _. _._ _.16
2.1.3.1. Verbrauchsmaterialien_16
2.1.3.2. Geräte_._16
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2.2. Methoden_17
2.2.1. Präparation mononukleärer Zellen _ .„17
2.2.2. Durchführung der Zellkultur._. _ _ _ _17
2.2.3. Durchführung der Immunmodulationsversuche_20
2.2.3.1. Vorbereitung und Applikation der Proben_ 21
2.2.3.2. Durchführung und Messung der ELISA- Systeme 22
2.2.3.2.1. Prinzip der Methode_22
2.2.3.2.2. Beschichtung der ELISA- Platten_-23
IV
2.2.3.2.3. Erstellung und Auftragung der Standard-Verdünnungsreihe 24
2.2.3.2.4. Auftragung der Kulturüberstände_24
2.2.3.2.5. Herstellung und Auftragung der biotinylierten Detektions-Antikörper_24
2.2.3.2.6. Anwendung der Substratpuffer im ELISA „_._._ _._._._ 25
2.2.3.2.7. Messung und Auswertung der ELISA-Systeme_25
2.2.3.3. MTT-Test_25
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2.2.3.4. Nachweis der m-RNA Expression von Zytokinen mittels real-Time PCR_26
2.2.3.4.1. mRNA-Präparation_26
2.2.3.4.2. cDNA-Synthese._._._._._.„._._.„27
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2.2.4. Statistische Auswertung_30
3. Ergebnisse_30
3.1. In vitro Modell zur Bestimmung immunmodulatorischer Effekte_30
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3.1.2. Zytokinproduktion nach ahCD3/ ahCD28- Stimulation_31
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