DNA-Nachweis und p53-Mutationsanalyse im Atemkondensat:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
Titelblatt 1
Bibliographische Beschreibung 2
Widmung 3
Inhaltsverzeichnis 4
A Einleitung 8
A1. Lungenkarzinome 8
A1.1. Epidemiologie 8
A1.2. Einteilung 9
A 1.2.1. Einteilung nach der Histologie 9
A 1.2.2. Einteilung nach der Lokalisation 10
A 1.2.3. TNM Klassifikation und Stadieneinteilung 10
A 1.2.4. Histopathologisches Grading 12
A1.3. Äthiologie 12
A 1.3.1. „Field Cancerisation und „Multistep Carcinogenesis 13
A1.4. Diagnostik, Therapie und Prognose 14
A2. Genetische Veränderungen im Rahmen der Karzinogenese 18
A2.1. Das Tumorsuppressorgen p53 19
A 2.1.1. Zellzyklusregulierung 19
A 2.1.2. Aufbau und molekulargenetische Aspekte 21
A 2.1.3. Veränderungen der p53 Funktion 24
A 3. Atemkondensatanalyse als nicht invasive Methode 27
A 3.1. Entstehung und Zusammensetzung des Atemkondensates 28
A 3.2. Einflussgrößen auf Atemkondensatmenge und entstehung 29
A 3.3. Mediatoren 29
A 3.4. IJ Actin als „house keeping Gen 30
B Fragestellung 32
i.
Seite
C Material und Methoden 33
C1. Geräte 33
C 2. Computerprogramme 33
C 3. Arbeitsmaterialien 34
C 4. Untersuchungsmaterialien 34
C 4.1. Atemkondensatproben für ß Aktin und p53 Analysen 34
C 4.2. Tumorgewebeproben 36
C 4.3. Zelllinien 37
C 5. Atemkondensat 37
C5.1. Prinzip der Atemkondensatentstehung 37
C 5.2. Durchführung der Atemkondensatgewinnung 37
C 6. Präparation genomischer DNA aus Atemkondensat 38
C6.1. Lösungen, Puffer und Reagenzien 38
C 6.2. Proteinase K Verdauung 38
C 6.3. Phenol Chloroform Extraktion 38
C 7. Präparation genomischer DNA aus Tumorgewebeproben 40
C 7.1. Lösungen, Pufferund Reagenzien 40
C 7.2. Schneiden des Paraffingewebes 40
C 7.3. Die Probenaufbereitung 40
C 8. PCR Analyse 41
C 8.1. Prinzip der nested PCR und semi nested PCR 41
C 8.2. Materialien 41
C 8.3. Primer 42
C 8.3.1. Primer für ß Actin PCR 42
C 8.3.2. Primer für p53 PCR 42
C 8.4. Reaktionsansätze 43
C 8.4.1. Reaktionsansatz der ß Actin PCR 44
C 8.4.2. Reaktionsansatz der p53 PCR 45
C 8.5. PCR Bedingungen 45
C 8.6. Bestimmung der Temperaturgradienten 45
C 8.7. Bestimmung der Nachweisgrenze für ß Actin 46
5
Seite
C 9. DNA Detektion durch Agarose Gelelektrophorese 46
C9.1. Materialien und Chemikalien 46
C 9.2. Herstellung des Agarose Gels 47
C 9.3. Auftrennung, Darstellung und Dokumentation der 47
PCR Produkte
C10. Aufreinigung der PCR Produkte 48
C11. Sequenzanalyse 49
C11.1. Reagenzien 49
C 11.2. Reaktionsansatz und Durchführung der Sequenzreaktion 50
C11.3. Herstellung des Elektrophorese Gels 51
C 11.4. Durchführung der Elektrophorese 51
C 11.5. Auswertung der Sequenzierung 52
C12. Statistische Auswertungen 52
D Ergebnisse 53
D1. PCR Analysen im Atemkondensat 53
D1.1. Bestimmung der Temperaturgradienten 53
D 1.1.1. Temperaturgradient von ß Actin 53
D 1.1.2. Temperaturgradienten von p53 53
D 1.2. Reproduzierbarkeit und methodische Untersuchungen 54
D 1.2.1. Einsatz von isolierter DNA 54
D 1.2.1.1. Vergleich der einzelnen Isolierungen bei Wiederholung 54
der Isolierungen
D 1.2.1.2. Einfluss der Fraktionierung 55
D 1.2.1.3. Vergleich der PCRs innerhalb einer Isolierung 56
D 1.2.2. Einsatz von nativem Atemkondensat 57
D1.2.3. Einfluss von Ampli Taq Gold 59
D1.3. Detektionsrate von ß Actin 60
D 1.4. Bestimmung der Nachweisgrenze für ß Actin 60
D1.5. p53 PCR aus Atemkondensat 61
D 1.5.1. Spezifität der nested PCR 61
D 1.5.2. Screening der Patientengruppe 62
D 1.5.3. Screening der gesunden Probanden 64
6
Seite
D 1.6. Vergleich von p53 und ß Actin PCR 65
D 2. p53 PCR Analyse der Tumorgewebeproben 66
D 3. Sequenzanalyse 66
D3.1. Ergebnisse beim Atemkondensat 66
D 3.1.1. Atemkondensat von NSCLC Patienten 66
D 3.1.2. Atemkondensat bei gesunden Probanden 68
D 3.2. Ergebnisse bei Tumorgewebeproben 68
D 3.3. Vergleich von Atemkondensat und Tumorgewebe 69
E Diskussion 71
Zusammenfassung 80
Abkürzungsverzeichnis 83
Abbildungsverzeichnis 85
Tabellenverzeichnis 87
Literaturverzeichnis 89
Danksagung 106
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 107
Lebenslauf 108
7
|
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Titelblatt 1
Bibliographische Beschreibung 2
Widmung 3
Inhaltsverzeichnis 4
A Einleitung 8
A1. Lungenkarzinome 8
A1.1. Epidemiologie 8
A1.2. Einteilung 9
A 1.2.1. Einteilung nach der Histologie 9
A 1.2.2. Einteilung nach der Lokalisation 10
A 1.2.3. TNM Klassifikation und Stadieneinteilung 10
A 1.2.4. Histopathologisches Grading 12
A1.3. Äthiologie 12
A 1.3.1. „Field Cancerisation" und „Multistep Carcinogenesis" 13
A1.4. Diagnostik, Therapie und Prognose 14
A2. Genetische Veränderungen im Rahmen der Karzinogenese 18
A2.1. Das Tumorsuppressorgen p53 19
A 2.1.1. Zellzyklusregulierung 19
A 2.1.2. Aufbau und molekulargenetische Aspekte 21
A 2.1.3. Veränderungen der p53 Funktion 24
A 3. Atemkondensatanalyse als nicht invasive Methode 27
A 3.1. Entstehung und Zusammensetzung des Atemkondensates 28
A 3.2. Einflussgrößen auf Atemkondensatmenge und entstehung 29
A 3.3. Mediatoren 29
A 3.4. IJ Actin als „house keeping" Gen 30
B Fragestellung 32
i.
Seite
C Material und Methoden 33
C1. Geräte 33
C 2. Computerprogramme 33
C 3. Arbeitsmaterialien 34
C 4. Untersuchungsmaterialien 34
C 4.1. Atemkondensatproben für ß Aktin und p53 Analysen 34
C 4.2. Tumorgewebeproben 36
C 4.3. Zelllinien 37
C 5. Atemkondensat 37
C5.1. Prinzip der Atemkondensatentstehung 37
C 5.2. Durchführung der Atemkondensatgewinnung 37
C 6. Präparation genomischer DNA aus Atemkondensat 38
C6.1. Lösungen, Puffer und Reagenzien 38
C 6.2. Proteinase K Verdauung 38
C 6.3. Phenol Chloroform Extraktion 38
C 7. Präparation genomischer DNA aus Tumorgewebeproben 40
C 7.1. Lösungen, Pufferund Reagenzien 40
C 7.2. Schneiden des Paraffingewebes 40
C 7.3. Die Probenaufbereitung 40
C 8. PCR Analyse 41
C 8.1. Prinzip der nested PCR und semi nested PCR 41
C 8.2. Materialien 41
C 8.3. Primer 42
C 8.3.1. Primer für ß Actin PCR 42
C 8.3.2. Primer für p53 PCR 42
C 8.4. Reaktionsansätze 43
C 8.4.1. Reaktionsansatz der ß Actin PCR 44
C 8.4.2. Reaktionsansatz der p53 PCR 45
C 8.5. PCR Bedingungen 45
C 8.6. Bestimmung der Temperaturgradienten 45
C 8.7. Bestimmung der Nachweisgrenze für ß Actin 46
5
Seite
C 9. DNA Detektion durch Agarose Gelelektrophorese 46
C9.1. Materialien und Chemikalien 46
C 9.2. Herstellung des Agarose Gels 47
C 9.3. Auftrennung, Darstellung und Dokumentation der 47
PCR Produkte
C10. Aufreinigung der PCR Produkte 48
C11. Sequenzanalyse 49
C11.1. Reagenzien 49
C 11.2. Reaktionsansatz und Durchführung der Sequenzreaktion 50
C11.3. Herstellung des Elektrophorese Gels 51
C 11.4. Durchführung der Elektrophorese 51
C 11.5. Auswertung der Sequenzierung 52
C12. Statistische Auswertungen 52
D Ergebnisse 53
D1. PCR Analysen im Atemkondensat 53
D1.1. Bestimmung der Temperaturgradienten 53
D 1.1.1. Temperaturgradient von ß Actin 53
D 1.1.2. Temperaturgradienten von p53 53
D 1.2. Reproduzierbarkeit und methodische Untersuchungen 54
D 1.2.1. Einsatz von isolierter DNA 54
D 1.2.1.1. Vergleich der einzelnen Isolierungen bei Wiederholung 54
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D 1.2.1.3. Vergleich der PCRs innerhalb einer Isolierung 56
D 1.2.2. Einsatz von nativem Atemkondensat 57
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D 1.4. Bestimmung der Nachweisgrenze für ß Actin 60
D1.5. p53 PCR aus Atemkondensat 61
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D 1.5.2. Screening der Patientengruppe 62
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6
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D 1.6. Vergleich von p53 und ß Actin PCR 65
D 2. p53 PCR Analyse der Tumorgewebeproben 66
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D 3.1.1. Atemkondensat von NSCLC Patienten 66
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D 3.2. Ergebnisse bei Tumorgewebeproben 68
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E Diskussion 71
Zusammenfassung 80
Abkürzungsverzeichnis 83
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