Untersuchungen zur Wirkung von Pasteurella multocida Toxin:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2007
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| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss., 2007 |
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS l
A EINLEITUNG 1
1 Pasteurella multocida Toxin 1
1.1 Aufnahme und Wirkung von PMT in Säugetierzellen 2
1.2 Aktivierung des Gq PLC Signaltransduktionsweges durch PMT 3
1.3 Mitogener Effekt von PMT 5
1.4 PMT Wirkungen auf das Zytoskelett: RhoA Aktivierung 6
1.5 Struktur von PMT 7
2 PMT und Signaltransduktion durch GTP bindende Proteine 8
2.1 Heterotrimere G Proteine 8
2.2 Kleine GTPasen (niedermolekulare GTP bindende Proteine) 15
B ZIELSETZUNG DER ARBEIT 18
C MATERIAL UND METHODEN 20
I MATERIAL 20
1 Bakterienstämme und Anzuchtmedien 20
1.1 Escherichia cott Stämme 20
1.2 Anzuchtmedium für Escherichia coli 20
2 Eukaryote Zelllinien 20
3 Plasmide und Vektoren 21
3.1 Bakterielle Expressionsvektoren 21
3.2 Retrovirale Expressionsvektoren 21
4 Antikörper und Antiseren 22
5 Biochemika und Chemikalien 22
5.1 Radionuklide 23
5 2 Sonstige Biochemika und Chemikalien 23
5.3 Enzyme 23
5.4 Oligonukleotide 23
6 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23
II METHODEN 25
1 Molekularbiologische Methoden 25
1.1 Piasmid DNA Präparation 25
1.2 DNA Konzentrationsbestimmung 26
1.3 Gelelektrophoretische DNA Auftrennung 26
1.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 27
INHALTSVERZEICHNIS —2.
1.5 Mutagenese von Monierten Genfragmenten 28
1.6 Transformation von Bakterien
1.7 DNA Sequenzierung
1.8 Synthese von Gaq cRNA 3Q
2 Proteinbiochemische Methoden 30
2.1 Proteinkonzentrationsbestimmung 30
2.2 Membrangewinnung 31
2.3 [35S]GTPYS Bindungsversuche 31
2.4 Immunopräzipitafion von Ga,
2.5 SDS Page (Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgel Elektrophorese) 34
2.6 Silber Färbung von SDS Polyacrylamid Gelen 35
2.7 Immunoblot Analyse (Western Blot Analyse) 3f5
2.8 Expression und Aufreinigung von GST Fusionsproteine 37
3 Zellbiologische Methoden 38
3.1 Analyse von Inositolphosphaten
3.2 Retroviraler Gentransfer 40
3.3 Bestimmung der Anzahl heptahelikaler Rezeptoren 40
3.4 Transfektion von HEK 293T Zellen und HEK M3 Zellen 41
3.5 Oozyten Präparation, Mikroinjektion und anschließende Immunopräzipitation 42
3.6 In vitro Translation 43
3.7 Bestimmung der Luciferase Aktivität 44
4 Auswertungsverfahren 45
4.1 Scatchard Plot Verfahren 45
D ERGEBNISSE 49
1 PMT potenziert die Agonist induzierte Stimulation des Gaq Trans
duktionssignalweges 4^
1.1 Potenzierender Effekt von PMT auf die Bombesin induzierte Inositolphosphat
Akkumulation 4^
1.2 PMT vermittelte Stimulation der Bombesin bzw. Vasopressin induzierten GTPyS
Bindung an Gaq 50
1.3 Die biologisch inaktive Mutante PMT01165S zeigt keine Stimulation der Agonist
induzierten GTPyS Bindung 52
2 Konzentration und Zeitabhängigkeit des PMT Effekts 53
2.1 Abhängigkeit der Stimulation der Bombesin induzierten GTPyS Bindung von der
Intoxikationszeit mit PMT 53
INHAL TS VERZEICHNIS m
2.2 Konzentrationsabhangigkeit der Stimulation der Bombesin induzierten GTPyS
Bindung 54
3 Abhangigkeit des PMT Effektes von Gq 55
3.1 Aktivierung von Gaq und nicht von Gan 56
3.2 Einfluss von PMTauf die Expression von Gaq 57
3.3 Einfluss von PMTauf die Immunoprazipitation von Ga, 57
3.4 Nachweis der Anzahl aktivierter Gaq Proteine 58
4 Bestimmung der Anzahl Gq/1, gekoppelter Rezeptoren 60
5 Abhangigkeit des PMT Effekts von der Prasenz und Aktivitat des Toxins 62
5.1 Die PMT vermittelte Stimulation der Agonist induzierten GTPYS Bindung ist nicht
von der Anwesenheit des Toxins abhangig 62
5.2 Die Aktivitat von PMT ist nach Aktivierung von Gaq nicht mehr notwendig 64
5.3 Inhibition der PMT Aktivitat durch den anti PMT Antikorper 65
6 PMT induzierte Phosphorylierung des Tyrosins 356 von Gaq und ihre
Auswirkung auf die Agonist induzierte GTPyS Bindung 66
6.1 PMT 1 fuhrt zur Phosphorylierung des Tyrosins 356 67
6.2 GaqY356F zeigt wie Go, nach Stimulation mit PMT eine Zunahme der Agonist
induzierten GTPyS Bindung 68
6.3 GaqY356F zeigt wie Go, 1 nach Stimulation mit PMT und Agonisten eine
vergleichbare Zunahme in der Inositolphosphat Akkumulation 71
7 PMT bleibt nicht an Gaq gebunden 72
8 Untersuchungen zur Kinetik der GTPyS Bindung 73
9 Einfluss von PMT auf die Bombesin induzierte Desensitisierung 75
10 Wirkung von YM 254890 auf die Agonist induzierte GTPvS Bindung an Gaq 77
10.1 YM 254890 blockiert in vitro die Agonist induzierte GTPyS Bindung 77
10.2 Zeitabhangige Freisetzung des gebundenen GTPyS durch YM 254890 78
10.3 Unterschiedliche Freisetzung des gebundenen GTPyS durch YM 254890 in
Membranen von unbehandelten und PMT behandelten Zellen 79
10.4 Die unterschiedliche Freisetzung des gebundenen GTPyS durch YM 254890
bleibt konstant auch nach langerer Inkubation mit YM 254890 80
10.5 Inhibition der PMT induzierten Inositolphosphat Akkumulation durch YM 254890 82
10.6 Stimulation von Gaq nach Vorbehandlung mit YM 254890 83
11 PMT aktiviert den Ga12m Signaltransduktionsweg 84
11.1 RhoA Aktivierung in G,/,, und Gi2/i3 defizienten Mausfibroblasten 84
11.2 Rekonstitution von Gu* in C^n defizienten Zellen 86
12 Untersuchungen zur Struktur von Gaq nach Aktivierung durch PMT 87
INHALTSVERZEICHNIS IV
12.1 Immunopräzipitation von endogenem Ga, 87
12.2 Immunopräzipitation von überexprimiertem Gotq, gefolgt von Coomassie Färbung
der Immunopräzipitate und MALDI TOF MS Analyse 88
E DISKUSSION 91
1 PMT vermittelte Stimulation der Agonist induzierten GTPvS Bindung an Gaq 92
1.1 Untersuchungen zur Stimulation der Agonist induzierten GTPvS Bindung 94
1.2 PMT induzierte Phosphorylierung des Tyrosins 356 und ihre Auswirkung auf die
Stimulation der Agonist induzierten G, Aktivierung 97
1.3 Untersuchungen zur Kinetik der Agonist induzierten GTPvS Bindung 99
2 Einfluss von YM 254890 auf den synergistischen Effekt von PMT 99
3 PMT induzierte RhoA Aktivierung 100
4 Untersuchungen zur Struktur von Gaq nach PMT Aktivierung 103
F ZUSAMMENFASSUNG 104
G LITERATURVERZEICHNIS 107
H ANHANG 113
1 Abkürzungen 113
2 Sequenzen 115
2.1 Sequenz des Pasteurella multocida Toxins 115
2.2 Sequenz von murinem Gaq 117
2.3 Sequenz von murinem Ga,, 118
2.4 Sequenzvergleich von murinem Gaq und Gau 119
3 Primer Sequenzen 119
3.1 Mutationsprimer 119
4 Publikationen 120
5 Poster 120
6 Danksagungen 121
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS l
A EINLEITUNG 1
1 Pasteurella multocida Toxin 1
1.1 Aufnahme und Wirkung von PMT in Säugetierzellen 2
1.2 Aktivierung des Gq PLC Signaltransduktionsweges durch PMT 3
1.3 Mitogener Effekt von PMT 5
1.4 PMT Wirkungen auf das Zytoskelett: RhoA Aktivierung 6
1.5 Struktur von PMT 7
2 PMT und Signaltransduktion durch GTP bindende Proteine 8
2.1 Heterotrimere G Proteine 8
2.2 Kleine GTPasen (niedermolekulare GTP bindende Proteine) 15
B ZIELSETZUNG DER ARBEIT 18
C MATERIAL UND METHODEN 20
I MATERIAL 20
1 Bakterienstämme und Anzuchtmedien 20
1.1 Escherichia cott Stämme 20
1.2 Anzuchtmedium für Escherichia coli 20
2 Eukaryote Zelllinien 20
3 Plasmide und Vektoren 21
3.1 Bakterielle Expressionsvektoren 21
3.2 Retrovirale Expressionsvektoren 21
4 Antikörper und Antiseren 22
5 Biochemika und Chemikalien 22
5.1 Radionuklide 23
5 2 Sonstige Biochemika und Chemikalien 23
5.3 Enzyme 23
5.4 Oligonukleotide 23
6 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23
II METHODEN 25
1 Molekularbiologische Methoden 25
1.1 Piasmid DNA Präparation 25
1.2 DNA Konzentrationsbestimmung 26
1.3 Gelelektrophoretische DNA Auftrennung 26
1.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 27
INHALTSVERZEICHNIS —2.
1.5 Mutagenese von Monierten Genfragmenten 28
1.6 Transformation von Bakterien
1.7 DNA Sequenzierung "
1.8 Synthese von Gaq cRNA 3Q
2 Proteinbiochemische Methoden 30
2.1 Proteinkonzentrationsbestimmung 30
2.2 Membrangewinnung 31
2.3 [35S]GTPYS Bindungsversuche 31
2.4 Immunopräzipitafion von Ga,
2.5 SDS Page (Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgel Elektrophorese) 34
2.6 Silber Färbung von SDS Polyacrylamid Gelen 35
2.7 Immunoblot Analyse (Western Blot Analyse) 3f5
2.8 Expression und Aufreinigung von GST Fusionsproteine 37
3 Zellbiologische Methoden 38
3.1 Analyse von Inositolphosphaten
3.2 Retroviraler Gentransfer 40
3.3 Bestimmung der Anzahl heptahelikaler Rezeptoren 40
3.4 Transfektion von HEK 293T Zellen und HEK M3 Zellen 41
3.5 Oozyten Präparation, Mikroinjektion und anschließende Immunopräzipitation 42
3.6 In vitro Translation 43
3.7 Bestimmung der Luciferase Aktivität 44
4 Auswertungsverfahren 45
4.1 Scatchard Plot Verfahren 45
D ERGEBNISSE 49
1 PMT potenziert die Agonist induzierte Stimulation des Gaq Trans
duktionssignalweges 4^
1.1 Potenzierender Effekt von PMT auf die Bombesin induzierte Inositolphosphat
Akkumulation 4^
1.2 PMT vermittelte Stimulation der Bombesin bzw. Vasopressin induzierten GTPyS
Bindung an Gaq 50
1.3 Die biologisch inaktive Mutante PMT01165S zeigt keine Stimulation der Agonist
induzierten GTPyS Bindung 52
2 Konzentration und Zeitabhängigkeit des PMT Effekts 53
2.1 Abhängigkeit der Stimulation der Bombesin induzierten GTPyS Bindung von der
Intoxikationszeit mit PMT 53
INHAL TS VERZEICHNIS m
2.2 Konzentrationsabhangigkeit der Stimulation der Bombesin induzierten GTPyS
Bindung 54
3 Abhangigkeit des PMT Effektes von Gq 55
3.1 Aktivierung von Gaq und nicht von Gan 56
3.2 Einfluss von PMTauf die Expression von Gaq 57
3.3 Einfluss von PMTauf die Immunoprazipitation von Ga, 57
3.4 Nachweis der Anzahl aktivierter Gaq Proteine 58
4 Bestimmung der Anzahl Gq/1, gekoppelter Rezeptoren 60
5 Abhangigkeit des PMT Effekts von der Prasenz und Aktivitat des Toxins 62
5.1 Die PMT vermittelte Stimulation der Agonist induzierten GTPYS Bindung ist nicht
von der Anwesenheit des Toxins abhangig 62
5.2 Die Aktivitat von PMT ist nach Aktivierung von Gaq nicht mehr notwendig 64
5.3 Inhibition der PMT Aktivitat durch den anti PMT Antikorper 65
6 PMT induzierte Phosphorylierung des Tyrosins 356 von Gaq und ihre
Auswirkung auf die Agonist induzierte GTPyS Bindung 66
6.1 PMT""1 fuhrt zur Phosphorylierung des Tyrosins 356 67
6.2 GaqY356F zeigt wie Go,"" nach Stimulation mit PMT eine Zunahme der Agonist
induzierten GTPyS Bindung 68
6.3 GaqY356F zeigt wie Go,""1 nach Stimulation mit PMT und Agonisten eine
vergleichbare Zunahme in der Inositolphosphat Akkumulation 71
7 PMT bleibt nicht an Gaq gebunden 72
8 Untersuchungen zur Kinetik der GTPyS Bindung 73
9 Einfluss von PMT auf die Bombesin induzierte Desensitisierung 75
10 Wirkung von YM 254890 auf die Agonist induzierte GTPvS Bindung an Gaq 77
10.1 YM 254890 blockiert in vitro die Agonist induzierte GTPyS Bindung 77
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10.3 Unterschiedliche Freisetzung des gebundenen GTPyS durch YM 254890 in
Membranen von unbehandelten und PMT behandelten Zellen 79
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bleibt konstant auch nach langerer Inkubation mit YM 254890 80
10.5 Inhibition der PMT induzierten Inositolphosphat Akkumulation durch YM 254890 82
10.6 Stimulation von Gaq nach Vorbehandlung mit YM 254890 83
11 PMT aktiviert den Ga12m Signaltransduktionsweg 84
11.1 RhoA Aktivierung in G,/,, und Gi2/i3 defizienten Mausfibroblasten 84
11.2 Rekonstitution von Gu* in C^n defizienten Zellen 86
12 Untersuchungen zur Struktur von Gaq nach Aktivierung durch PMT 87
INHALTSVERZEICHNIS IV
12.1 Immunopräzipitation von endogenem Ga, 87
12.2 Immunopräzipitation von überexprimiertem Gotq, gefolgt von Coomassie Färbung
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E DISKUSSION 91
1 PMT vermittelte Stimulation der Agonist induzierten GTPvS Bindung an Gaq 92
1.1 Untersuchungen zur Stimulation der Agonist induzierten GTPvS Bindung 94
1.2 PMT induzierte Phosphorylierung des Tyrosins 356 und ihre Auswirkung auf die
Stimulation der Agonist induzierten G, Aktivierung 97
1.3 Untersuchungen zur Kinetik der Agonist induzierten GTPvS Bindung 99
2 Einfluss von YM 254890 auf den synergistischen Effekt von PMT 99
3 PMT induzierte RhoA Aktivierung 100
4 Untersuchungen zur Struktur von Gaq nach PMT Aktivierung 103
F ZUSAMMENFASSUNG 104
G LITERATURVERZEICHNIS 107
H ANHANG 113
1 Abkürzungen 113
2 Sequenzen 115
2.1 Sequenz des Pasteurella multocida Toxins 115
2.2 Sequenz von murinem Gaq 117
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2.4 Sequenzvergleich von murinem Gaq und Gau 119
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