Der Nachweis des Zytomegalievirus in Leukozyten des peripheren Blutes organtransplantierter Patienten mit Hilfe der In-situ-Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
Bibliographische Beschreibung
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einführung
1.1 Zytomegalievirusinfektion 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.2 Aufbau und Replikation des Zytomegalievirus 1
1.1.3 Zytomegalievirusinfektion bei Transplantationspatienten 2 5
1.2 Etablierte Nachweismethoden für das Zytomegalievirus 6
1.2.1 Nachweis mittels serologischer Verfahren 6
1.2.2 Nachweis mittels Zellkultur 6
1.2.3 Nachweis des virusspezifischen Antigens mittels monoklonaler Antikörper 7
1.2.4 Nachweis der virusspezifischen DNA mittels in situ Hybridisierung 7
1.3 Nachweis des Zytomegalievirus mittels Polymerasekettenreaktion 7
1.3.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion 7
1.3.2 Grundzüge der nested Polymerasekettenreaktion 8
1.3.3 Grundzüge der in situ Polymerasekettenreaktion 8
1.3.4 Grundzüge der in cell Polymerasekettenreaktion 9
1.4 Ziel der Arbeit 9
2 Material und Methoden
2.1 Auswahl der Patienten 10
2.2 Gewinnung und Aufbereitung des verwendeten Zellmaterials 10
2.2.1 Leukozytenseparation aus Patientenblut 10
2.2.2 Angewendete Zellkultivierung 11
2.2.3 Bestimmung der Zellzahl 12
2.2.4 Fixierung der Zellen 12 14
2.3 Zytozentrifugationsverfahren 14
2.4 Reinigung und Bestimmung von Nukleinsäuren 15
2.4.1 Isolierung der RNA 15
2.4.2 Isolierung der genomischen DNA 16
2.4.3 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 17
2.4.4 Filtration der Primer 17
2.4.5 Beschreibung der verwendeten Primersequenzen 18
2.5 Verfahren der Polymerasekettenreaktion 18 20
2.5.1 Reverse Transkriptase Reaktion 20
2.5.2 Polymerasekettenreaktion unter Nutzung der Taq DNA Polymerase 21
2.5.3 Gekoppelte Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion 22
2.5.4 Single tube Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
mit der rekombinanten Thermus thermophilus DNA Polymerase 23 25
2.6 In situ Polymerasekettenreaktion 25
2.6.1 In situ Reverse Transkriptase Reaktion 25
2.6.2 In situ Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion unter
Nutzung der Amplitaq® GOLD DNA Polymerase 26
2.6.3 In situ Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion unter
TM
Nutzung des Titan One Tube RT PCR Systems 27 29
2.7 Verfahrensoptimierung durch Variation der Methodik 29
2.7.1 Waschen der Objektträger mit SSC Puffer 29
2.7.2 Kernfärbeverfahren 30
2.7.3 Produktakkumulation in Abhängigkeit von der Zyklenanzahl 30
2.7.4 Verminderung unspezifischer Färbung mittels RNase/DNase Verdau 31
2.7.5 Auswahl der Primerpaare 31
2.7.6 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch Variation
der eingesetzten Enzymaktivität 31
2.7.7 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch Variation
der eingesetzten Magnesiumionenkonzentration 32
2.7.8 Nachweis der Prozessspezifität mittels Negativkontrollen 32
2.8 Referenzmethoden zur Diagnostik des Zytomegalievirus 32
2.8.1 Durchführung der nested Polymerasekettenreaktion 32 33
2.8.2 Durchführung der in cell Polymerasekettenreaktion 34
2.8.3 Bestimmung des spezifischen Antigens pp65 und der spezifischen
Antikörper 34
2.9 Auswertung der angewendeten diagnostischen Methoden 34
2.9.1 Analyse mittels Auf licht und Fluoreszenzmikroskopie 34
2.9.2 Analyse mittels Agarosegelelektrophorese 35 37
2.10 Indikation und Überwachung der antiviralen Therapie am Beispiel des
Ganciclovirs 37
2.11 Spezifität und Sensitivität der in situ Polymerasekettenreaktion 37 38
3 Ergebnisse
3.1 Etablierung der in situ Reversen Transkriptase Polymerasekettenreaktion
für das zytomegalievirusspezifische Immediate Early Antigen 39
3.1.1 Einfluss der Objektträgerbeschichtung auf die resultierende Zellausbeute 39
3.1.2 Einfluss von Fixierung und Digestion der eingesetzten Zellen auf die
Effektivität der in situ Polymerasekettenreaktion 39
3.1.3 Auswirkung der Variation spezieller Reaktionskomponenten
der Polymerasekettenreaktion 40
3.1.3.1 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch
Variation der eingesetzten Magnesiumionenkonzentration 40
3.1.3.2 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch
Variation der eingesetzten Enzymaktivität 41
3.1.3.3 Vergleich der Amplitaq® Gold DNA Polymerase mit dem Titan™ System 41
3.1.3.4 Einfluss der Amplifikatlänge 42
3.1.4 Einfluss der Zyklenzahl auf die Amplifikationsergebnisse der PCR 43
3.2 Auswertung und Visualisierung 43 45
3.3 Vergleich der in situ Polymerasekettenreaktion mit den
alternativen Nachweismethoden für das Zytomegalievirus 45
3.3.1 Vergleich der in situ PCR mit der nested PCR 45
3.3.2 Vergleich der in situ PCR mit dem Nachweis des CMV Antigens pp65 46 49
3.3.3 Vergleich der in situ PCR mit dem Nachweis des spezifischen IgM 49
3.3.4 Vergleich in situ PCR mit der Anzahl der peripheren Leukozyten 50
3.4 Ergebnis der Negativkontrollen 50
3.5 Inzidenz der zytomegalievirusassoziierten Erkrankung in Beziehung
zum präoperativen serologischen Spender bzw. Empfängerstatus 51 52
4 Diskussion 53 61
5 Zusammenfassung 62 64
6 Literaturverzeichnis 65
|
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Bibliographische Beschreibung
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einführung
1.1 Zytomegalievirusinfektion 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.2 Aufbau und Replikation des Zytomegalievirus 1
1.1.3 Zytomegalievirusinfektion bei Transplantationspatienten 2 5
1.2 Etablierte Nachweismethoden für das Zytomegalievirus 6
1.2.1 Nachweis mittels serologischer Verfahren 6
1.2.2 Nachweis mittels Zellkultur 6
1.2.3 Nachweis des virusspezifischen Antigens mittels monoklonaler Antikörper 7
1.2.4 Nachweis der virusspezifischen DNA mittels in situ Hybridisierung 7
1.3 Nachweis des Zytomegalievirus mittels Polymerasekettenreaktion 7
1.3.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion 7
1.3.2 Grundzüge der nested Polymerasekettenreaktion 8
1.3.3 Grundzüge der in situ Polymerasekettenreaktion 8
1.3.4 Grundzüge der in cell Polymerasekettenreaktion 9
1.4 Ziel der Arbeit 9
2 Material und Methoden
2.1 Auswahl der Patienten 10
2.2 Gewinnung und Aufbereitung des verwendeten Zellmaterials 10
2.2.1 Leukozytenseparation aus Patientenblut 10
2.2.2 Angewendete Zellkultivierung 11
2.2.3 Bestimmung der Zellzahl 12
2.2.4 Fixierung der Zellen 12 14
2.3 Zytozentrifugationsverfahren 14
2.4 Reinigung und Bestimmung von Nukleinsäuren 15
2.4.1 Isolierung der RNA 15
2.4.2 Isolierung der genomischen DNA 16
2.4.3 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 17
2.4.4 Filtration der Primer 17
2.4.5 Beschreibung der verwendeten Primersequenzen 18
2.5 Verfahren der Polymerasekettenreaktion 18 20
2.5.1 Reverse Transkriptase Reaktion 20
2.5.2 Polymerasekettenreaktion unter Nutzung der Taq DNA Polymerase 21
2.5.3 Gekoppelte Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion 22
2.5.4 "Single tube" Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
mit der rekombinanten Thermus thermophilus DNA Polymerase 23 25
2.6 In situ Polymerasekettenreaktion 25
2.6.1 In situ Reverse Transkriptase Reaktion 25
2.6.2 In situ Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion unter
Nutzung der Amplitaq® GOLD DNA Polymerase 26
2.6.3 In situ Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion unter
TM
Nutzung des Titan One Tube RT PCR Systems 27 29
2.7 Verfahrensoptimierung durch Variation der Methodik 29
2.7.1 Waschen der Objektträger mit SSC Puffer 29
2.7.2 Kernfärbeverfahren 30
2.7.3 Produktakkumulation in Abhängigkeit von der Zyklenanzahl 30
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2.7.5 Auswahl der Primerpaare 31
2.7.6 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch Variation
der eingesetzten Enzymaktivität 31
2.7.7 Optimierung der in situ Polymerasekettenreaktion durch Variation
der eingesetzten Magnesiumionenkonzentration 32
2.7.8 Nachweis der Prozessspezifität mittels Negativkontrollen 32
2.8 Referenzmethoden zur Diagnostik des Zytomegalievirus 32
2.8.1 Durchführung der nested Polymerasekettenreaktion 32 33
2.8.2 Durchführung der in cell Polymerasekettenreaktion 34
2.8.3 Bestimmung des spezifischen Antigens pp65 und der spezifischen
Antikörper 34
2.9 Auswertung der angewendeten diagnostischen Methoden 34
2.9.1 Analyse mittels Auf licht und Fluoreszenzmikroskopie 34
2.9.2 Analyse mittels Agarosegelelektrophorese 35 37
2.10 Indikation und Überwachung der antiviralen Therapie am Beispiel des
Ganciclovirs 37
2.11 Spezifität und Sensitivität der in situ Polymerasekettenreaktion 37 38
3 Ergebnisse
3.1 Etablierung der in situ Reversen Transkriptase Polymerasekettenreaktion
für das zytomegalievirusspezifische Immediate Early Antigen 39
3.1.1 Einfluss der Objektträgerbeschichtung auf die resultierende Zellausbeute 39
3.1.2 Einfluss von Fixierung und Digestion der eingesetzten Zellen auf die
Effektivität der in situ Polymerasekettenreaktion 39
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Variation der eingesetzten Enzymaktivität 41
3.1.3.3 Vergleich der Amplitaq® Gold DNA Polymerase mit dem Titan™ System 41
3.1.3.4 Einfluss der Amplifikatlänge 42
3.1.4 Einfluss der Zyklenzahl auf die Amplifikationsergebnisse der PCR 43
3.2 Auswertung und Visualisierung 43 45
3.3 Vergleich der in situ Polymerasekettenreaktion mit den
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3.3.1 Vergleich der in situ PCR mit der nested PCR 45
3.3.2 Vergleich der in situ PCR mit dem Nachweis des CMV Antigens pp65 46 49
3.3.3 Vergleich der in situ PCR mit dem Nachweis des spezifischen IgM 49
3.3.4 Vergleich in situ PCR mit der Anzahl der peripheren Leukozyten 50
3.4 Ergebnis der Negativkontrollen 50
3.5 Inzidenz der zytomegalievirusassoziierten Erkrankung in Beziehung
zum präoperativen serologischen Spender bzw. Empfängerstatus 51 52
4 Diskussion 53 61
5 Zusammenfassung 62 64
6 Literaturverzeichnis 65 |
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