MHC-unabhängige tumorspezifische T-Zellaktivierung durch rekombinante Immunrezeptoren mit kombinierter CD28-CD3 zeta Signalleitung:
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2006
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|---|---|
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Kapitel Seite
1 Einleitung 1
1.1 Eigenschaften von Tumorzellen 1
1.2 Das Carcino-embryonale Antigen (CEA) 2
1.3 Die adaptive Immunantwort und das Problem der adäquaten Stimulation 2
1.4 Immuntherapie bei malignen Tumoren 3
1.4.1 Vakzinierung mit dendritischen Zellen 4
1.4.2 Anpassungsstrategien des Tumors 4
1.4.3 Tumor-spezifische T-Zell Aktivierung mit Hilfe von bispezifischen
Antikörpern 5
1.4.4 Rekombinante T-Zellrezeptoren 6
1.5 Zielsetzung der Arbeit 8
2 Material 10
2.1 Stammlösungen und Puffer 10
2.2 Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese 10
2.3 Marker für die Gelelektrophorese 11
2.4 Medien für Bakterienkultur und Medienzusätze 12
2.5 Medien für Zellkultur und Medienzusätze 13
2.6 Bakterienstämme 14
2.7 Zelllinien 14
2.8 Antikörper und Antiseren 15
2.9 Sonstige Proteine 17
2.10 Primer-Oligonukleotide 17
2.11 Vektoren 18
3 Methoden 19
3.1 Präparation von Plasmid-DNS 19
3.1.1 Midi-Präparation von Plasmid-DNS durch Bindung an eine
Anionenaustauscher-Säule 19
3.1.2 Schnellpräparation von Plasmid-DNS nach der Koch-(boiling) Methode 19
3.1.3 Ethanolfällung 20
3.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 20
3.2.1 Photometrische Bestimmung 20
3.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel im Vergleich zu Markerbanden 20
3.3 Gelelektrophorese 21
3.3.1 Native Agarose-Gelelektrophorese 21
3.3.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 21
3.4 Western-Blot Verfahren 22
3.5 Isolierung von DNS-Fragmenten aus Agarose durch Bindung an Siliciumpartikel 23
3.6 Enzymatische Reaktionen mit doppelsträngiger DNS 23
3.6.1 Spaltung der doppelsträngigen DNS durch Restriktions-Endonukleasen 23
3.6.2 Ligation von DNS-Doppelsträngen mit überlappenden kohäsiven Enden
durch T4-DNS-Ligase 24
3.7 Bakterienkultur 25
3.7.1 Herstellung kompetenter E.coli DH5ot Bakterien 25
3.7.2 Transformation kompetenter £.co/iDH5a Bakterien 25
3.8 Polymerase-Kettenreaktion 26
3.9 Plasmid-Sequenzierung nach der Kettenabbruch-Methode 27
3.10 Zellkultur 28
3.10.1 Trypsinierung und Resuspendierung adhärenter Zellen 29
3.10.2 Kryokonservierung 29
3.10.3 Isolierung von T-Zellen 29
3.10.3.1 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentrifugation 29
3.10.3.2 Magnetseparation peripherer CD4+ und CD8* T-Zellen 30
3.10.4 Transduktion primärer T-Zellen 30
3.10.5 Immunfluoreszenz (FACS) - Analysen 31
3.10.6 Funktionstests 32
3.10.6.1 Stimulation transduzierter Lymphozyten durch
Kokultivierung 32
3.10.6.2 XTT-Test 32
3.10.6.3 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest zur Bestimmung
von IFNy und IL-2 (ELISA) 33
3.10.6.4 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest zum Nachweis
des Fc - Teils des Rezeptors 34
3.10.6.5 Ermittlung der Proliferationskapazität der T - Zellen
Einbau von BrdU 34
3.10.7 Herstellung der Zell-Lysate 35
4 Ergebnisse 36
4.1 Generierung der Expressionskassetten für die rekombinanten Rezeptoren 36
4.1.1 Klonierung des Rezeptors BW431/26 scFv-Fc-CD28-£ (#607) 36
4.1.2 Klonierung des Rezeptors BW431/26 scFv-Fc-CD28 (#637) 39
4.2 Expression der rekombinanten Rezeptoren 41
4.2.1 Expression in 293T Zellen 41
4.2.2 Expression in Lymphozyten aus dem peripheren Blut 42
4.3 Nachweis der Rezeptordomänen 43
4.3.1 Nachweis der scFv-und der Fc-Domäne des Rezeptors
BW431/26 scFv - Fc - CD28 - £ (#607) 43
4.3.2 Nachweis der CD3 ^-Kette und der CD28 Domäne des Rezeptors
BW431/26scFv-Fc-CD28-;(#607) 44
4.4 Funktionelle Charakterisierung des BW431/26 scFv - Fc - CD28 -1,
(#607)- Rezeptors 46
4.4.1 Induktion der IFNy- und IL-2 - Sekretion der Rezeptor tragenden
T-Zellen bei Bindung an Festphasen-gekoppelte Antikörper 46
4.4.2 Spezifische Aktivierung der anti-CEA Rezeptor - tragenden T-Zellen
durch Ko-Kultur mit CEA-positiven Tumorzellen 49
4.4.2.1 Rezeptor - vermittelte Zytolyse 49
4.4.2.2 IFNy - und IL-2 - Sekretion der Rezeptor - tragenden
T - Zellen bei Ko-Kultur mit CEA+ Tumorzellen 52
4.4.3 Rezeptor-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen 53
4.4.4 Stabilität der Expression der Rezeptoren BW431/26 scFv-Fc-^ (#439) und
BW431/26 scFv-Fc-CD28-f; (#607) in Lymphozyten bei Langzeitkultur 55
5 Diskussion 58
6 Zusammenfassung 71
7 Literaturverzeichnis 73
8 Anhang 80
8.1 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Rezeptors
BW431/26scFv-Fc-CD28-C 80
8.2 Abkürzungsverzeichnis 86
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Kapitel Seite
1 Einleitung 1
1.1 Eigenschaften von Tumorzellen 1
1.2 Das Carcino-embryonale Antigen (CEA) 2
1.3 Die adaptive Immunantwort und das Problem der adäquaten Stimulation 2
1.4 Immuntherapie bei malignen Tumoren 3
1.4.1 Vakzinierung mit dendritischen Zellen 4
1.4.2 Anpassungsstrategien des Tumors 4
1.4.3 Tumor-spezifische T-Zell Aktivierung mit Hilfe von bispezifischen
Antikörpern 5
1.4.4 Rekombinante T-Zellrezeptoren 6
1.5 Zielsetzung der Arbeit 8
2 Material 10
2.1 Stammlösungen und Puffer 10
2.2 Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese 10
2.3 Marker für die Gelelektrophorese 11
2.4 Medien für Bakterienkultur und Medienzusätze 12
2.5 Medien für Zellkultur und Medienzusätze 13
2.6 Bakterienstämme 14
2.7 Zelllinien 14
2.8 Antikörper und Antiseren 15
2.9 Sonstige Proteine 17
2.10 Primer-Oligonukleotide 17
2.11 Vektoren 18
3 Methoden 19
3.1 Präparation von Plasmid-DNS 19
3.1.1 Midi-Präparation von Plasmid-DNS durch Bindung an eine
Anionenaustauscher-Säule 19
3.1.2 Schnellpräparation von Plasmid-DNS nach der Koch-(boiling) Methode 19
3.1.3 Ethanolfällung 20
3.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 20
3.2.1 Photometrische Bestimmung 20
3.2.2 Mengenabschätzung im Agarosegel im Vergleich zu Markerbanden 20
3.3 Gelelektrophorese 21
3.3.1 Native Agarose-Gelelektrophorese 21
3.3.2 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 21
3.4 Western-Blot Verfahren 22
3.5 Isolierung von DNS-Fragmenten aus Agarose durch Bindung an Siliciumpartikel 23
3.6 Enzymatische Reaktionen mit doppelsträngiger DNS 23
3.6.1 Spaltung der doppelsträngigen DNS durch Restriktions-Endonukleasen 23
3.6.2 Ligation von DNS-Doppelsträngen mit überlappenden kohäsiven Enden
durch T4-DNS-Ligase 24
3.7 Bakterienkultur 25
3.7.1 Herstellung kompetenter E.coli DH5ot Bakterien 25
3.7.2 Transformation kompetenter £.co/iDH5a Bakterien 25
3.8 Polymerase-Kettenreaktion 26
3.9 Plasmid-Sequenzierung nach der Kettenabbruch-Methode 27
3.10 Zellkultur 28
3.10.1 Trypsinierung und Resuspendierung adhärenter Zellen 29
3.10.2 Kryokonservierung 29
3.10.3 Isolierung von T-Zellen 29
3.10.3.1 Lymphozytenseparation mittels Dichtezentrifugation 29
3.10.3.2 Magnetseparation peripherer CD4+ und CD8* T-Zellen 30
3.10.4 Transduktion primärer T-Zellen 30
3.10.5 Immunfluoreszenz (FACS) - Analysen 31
3.10.6 Funktionstests 32
3.10.6.1 Stimulation transduzierter Lymphozyten durch
Kokultivierung 32
3.10.6.2 XTT-Test 32
3.10.6.3 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest zur Bestimmung
von IFNy und IL-2 (ELISA) 33
3.10.6.4 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest zum Nachweis
des Fc - Teils des Rezeptors 34
3.10.6.5 Ermittlung der Proliferationskapazität der T - Zellen
Einbau von BrdU 34
3.10.7 Herstellung der Zell-Lysate 35
4 Ergebnisse 36
4.1 Generierung der Expressionskassetten für die rekombinanten Rezeptoren 36
4.1.1 Klonierung des Rezeptors BW431/26 scFv-Fc-CD28-£ (#607) 36
4.1.2 Klonierung des Rezeptors BW431/26 scFv-Fc-CD28 (#637) 39
4.2 Expression der rekombinanten Rezeptoren 41
4.2.1 Expression in 293T Zellen 41
4.2.2 Expression in Lymphozyten aus dem peripheren Blut 42
4.3 Nachweis der Rezeptordomänen 43
4.3.1 Nachweis der scFv-und der Fc-Domäne des Rezeptors
BW431/26 scFv - Fc - CD28 - £ (#607) 43
4.3.2 Nachweis der CD3 ^-Kette und der CD28 Domäne des Rezeptors
BW431/26scFv-Fc-CD28-;(#607) 44
4.4 Funktionelle Charakterisierung des BW431/26 scFv - Fc - CD28 -1,
(#607)- Rezeptors 46
4.4.1 Induktion der IFNy- und IL-2 - Sekretion der Rezeptor tragenden
T-Zellen bei Bindung an Festphasen-gekoppelte Antikörper 46
4.4.2 Spezifische Aktivierung der anti-CEA Rezeptor - tragenden T-Zellen
durch Ko-Kultur mit CEA-positiven Tumorzellen 49
4.4.2.1 Rezeptor - vermittelte Zytolyse 49
4.4.2.2 IFNy - und IL-2 - Sekretion der Rezeptor - tragenden
T - Zellen bei Ko-Kultur mit CEA+ Tumorzellen 52
4.4.3 Rezeptor-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen 53
4.4.4 Stabilität der Expression der Rezeptoren BW431/26 scFv-Fc-^ (#439) und
BW431/26 scFv-Fc-CD28-f; (#607) in Lymphozyten bei Langzeitkultur 55
5 Diskussion 58
6 Zusammenfassung 71
7 Literaturverzeichnis 73
8 Anhang 80
8.1 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Rezeptors
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