Struktur- und Funktionsanalyse des Adenovirusproteins E3-14.7K zur Aufklärung funktioneller antiapoptotischer Proteindomänen im FAS- und TNFR1-Apoptose-Signalweg:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ^
1.1 Die TNF Superfamilie 8
1.2 Der Tumor Nekrose Faktor 9
1.3 DerFas Ligand 10
1.4 Apoptose 11
1.5 Die Induktion der Apoptose über die TNFR1 und Fas Signalkaskaden 12
1.6 Virale Strategien zur Inhibition der Apoptose 14
1.7 Inhibition der Apoptose durch Adenovirus Typ2 14
1.7.1 Die immunregulatorischen Proteine der E3 Region 15
1.7.2 Das Adenovirusprotein 14.7K und seine immunregulatorische
Wirkung 17
1.8 Zielsetzung der Arbeit 19
2 Material und Methoden 21
2.1 Material 21
2.2 Grundlegende Methoden 29
2.2.1 Gelelektrophorese von Plasmid DNA 29
2.2.2 Präparation von Plasmid DNA 29
2.2.3 Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 29
2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen 30
2.2.5 DNA Sequenzierung 30
2.2.6 PCR 30
2.2.7 Computerprogramme und Datenbanken 31
2.3 Zellkultur 32
2.3.1 Kultivierung und Konservierung muriner und humaner Zellli¬
nien 32
2.3.2 Stabile Transfektion muriner Zellen mittels retroviraler Trans
duktion 32
2
2.3.3 Zytotoxizitätsassay 33
2.4 Molekularbiologische Verfahren 34
2.4.1 Mutagenese 34
2.4.2 Transformation 36
2.4.3 Animpfen von Übernachtkulturen 36
2.4.4 Isolierung von DNA aus Bakterien 36
2.5 Proteinchemische Verfahren 36
2.5.1 Herstellung von Gesamtproteinextrakten 36
2.5.2 Quantitative Proteinbestimmung 37
2.5.3 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese 37
2.5.4 Immuno Blot 38
3 Ergebnisse 40
3.1 Systematische Mutagenese des 14.7K Gens 40
3.1.1 Konstruktion der Mutanten des 14.7K Gens 40
3.1.2 Klonierung der Mutanten in den Expressionsvektor pQCXIP
und transiente Produktion von Retroviren 41
3.2 Stabile Transformation des 14.7K Gens in murine NW 3T3 Fibroblas
ten und Analyse der antiapoptotischen Wirkung von 14.7K auf die
TNFR1 und Fas Signalwege 42
3.3 TNF und Fas Ak Zytotoxizitätsassays 42
3.3.1 Sensibilisierung mit Cycloheximid 43
3.3.2 14.7K vermittelte Protektion gegen TNF und Fas Ak induzierte
Apoptose 43
3.4 Herstellung einer FLAG Epitop markierten Mutante F 14.7K 45
3.5 Vergleich der 14.7K Mutanten im Zytotoxizitätsassay mit TNF und Fas
Ak 47
3.5.1 Verlust des antiapoptotischen Effekts gegen TNF und Fas Ak . 47
3.5.2 Verlust des antiapoptotischen Effekts gegen TNF bei erhaltener
Protektion gegen Fas Ak 53
3.5.3 Erhaltung des antiapoptotischen Effekts gegen TNF und Fas Ak 53
3.6 Nachweis der Expression der 14.7K Mutanten in NIH 3T3 Fibroblasten
im Westemblot 56
4 Diskussion 58
4.1 Mutagenese des 14.7K Gens 59
3
4.2 Stabile Transfektion muriner Zellen mit Mutanten von 14.7K 60
4.3 Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays der 14.7K Mutanten 60
4.4 Nachweis der Expression von 14.7K im Westernblot 62
4.5 Funktionelle Proteindomänen von 14.7K 64
4.6 Angriffspunkte von 14.7K bei der Hemmung von TNF und FasL induzierter
Apoptose 65
4.6.1 Die „14.7K interacting proteins FIPs 66
4.6.2 Modell über die Angriffspunkte von 14.7K im TNFR1 und Fas
Signalweg 66
4.6.3 Ausblick 70
5 Zusammenfassung 71
Abbildungsverzeichnis 81
Tabellenverzeichnis 83
Selbständigkeitserklärung 84
Danksagung 85
Lebenslauf 86
4
Abbildungsverzeichnis
1.1 Induktion der Apoptose durch TNF und FasL 13
1.2 Schematiche Darstellung der wichtigsten Proteine in der E3 Region . 16
1.3 Mögliche Angriffspunkte der adenoviralen Proteine E1B 19K, RID und
14.7K zur Hemmung der durch TNF, FasL und TRAIL induzierten
Apoptose 19
3.1 Die Sequenz des 14.7K Gens und die Stellen des Moü vaustauschs durch
ein FLAG Epitop 41
3.2 Zytotoxizitätsassay der NIH 3T3 Parental und der NW 3T3 14.7K wt
Zellen bei Behandlung mit TNF 44
3.3 Zytotoxizitätsassay der NIH 3T3 Parental und der NIH 3T3 14.7K wt
Zellen bei Behandlung mit Fas Ak 44
3.4 NIH 3T3 F 14.7K , NIH 3T3 F 14.7K PM und NIH 3T3 14.7K wt Zellen
im Zytotoxizitätsassay bei Behandlung mit TNF 46
3.5 NIH 3T3 F 14.7K , NIH 3T3 F 14.7K PM und NIH 3T3 14.7K wt Zellen
im Zytotoxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak 46
3.6 Übersicht der einzelnen 14.7K Mutanten und deren Resistenz gegen¬
über TNF und Fas Ak vermittelter Apoptose 48
3.7 Mit den 14.7K Mutanten 1,3,4 und 5 transfizierte Zellen im Zytotoxi¬
zitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 49
3.8 Mit den 14.7K Mutanten 6,7,8 und 10 transfizierte Zellen im Zytotoxi¬
zitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 50
3.9 Mit den 14.7K Mutanten 11,12,13 und 14 transfizierte Zellen im Zyto¬
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 51
3.10 Mit den 14.7K Mutanten 15,17,22 und 24 transfizierte Zellen im Zyto¬
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 52
3.11 Mit den 14.7K Mutanten 0, 2, 9 und 23 transfizierte Zellen im Zytoto¬
xizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 54
81
3.12 Mit den 14.7K Mutanten 18,19,20 und 21 transfizierte Zellen im Zyto
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 55
3.13 Analyse der 14.7K Expression in HEK 293T und NIH 3T3 ZeUen im
Westernblot 57
3.14 Analyse der 14.7K Expression in HEK 293T und NIH 3T3 ZeUen im
Westemblot 57
4.1 Verhalten der mit 14.7K transfizierten Zellen im Zytotoxizitätsassay im
Vergleich mit den Ergebnissen von Ranheim et al 63
4.2 Funktion der vier bisher identifizierten FIPs und ihre Interaktion mit
anderen zellulären Signalproteinen 67
4.3 Schematische Darstellung möglicher Angriffspunkte von 14.7K zur Hem¬
mung der TNF und der FasL induzierten Apoptose 69
82
Tabellenverzeichnis
2.4 Reaktionsbedingungen der PCR bei Nutzung der Pfu DNA Polymerase 31
2.5 Reaktionsbedingungen der PCR bei Nutzung der Gold DNA Polymerase 31
2.6 URLs der verwendeten Websites 32
2.7 Reaktionsbedingungen bei Mutagenesen mit dem QuikChange Site Directed
Mutagenesis Kit 34
2.8 Standardreihe für die Proteinbestimmung (Kit nach Lowry) 37
2.9 Zusammensetzung der Trenngele für die SDS PAGE 38
2.10 Zusammensetzung des 5 % igen Sammelgels für die SDS PAGE .... 38
83
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ^
1.1 Die TNF Superfamilie 8
1.2 Der Tumor Nekrose Faktor 9
1.3 DerFas Ligand 10
1.4 Apoptose 11
1.5 Die Induktion der Apoptose über die TNFR1 und Fas Signalkaskaden 12
1.6 Virale Strategien zur Inhibition der Apoptose 14
1.7 Inhibition der Apoptose durch Adenovirus Typ2 14
1.7.1 Die immunregulatorischen Proteine der E3 Region 15
1.7.2 Das Adenovirusprotein 14.7K und seine immunregulatorische
Wirkung 17
1.8 Zielsetzung der Arbeit 19
2 Material und Methoden 21
2.1 Material 21
2.2 Grundlegende Methoden 29
2.2.1 Gelelektrophorese von Plasmid DNA 29
2.2.2 Präparation von Plasmid DNA 29
2.2.3 Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen 29
2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen 30
2.2.5 DNA Sequenzierung 30
2.2.6 PCR 30
2.2.7 Computerprogramme und Datenbanken 31
2.3 Zellkultur 32
2.3.1 Kultivierung und Konservierung muriner und humaner Zellli¬
nien 32
2.3.2 Stabile Transfektion muriner Zellen mittels retroviraler Trans
duktion 32
2
2.3.3 Zytotoxizitätsassay 33
2.4 Molekularbiologische Verfahren 34
2.4.1 Mutagenese 34
2.4.2 Transformation 36
2.4.3 Animpfen von Übernachtkulturen 36
2.4.4 Isolierung von DNA aus Bakterien 36
2.5 Proteinchemische Verfahren 36
2.5.1 Herstellung von Gesamtproteinextrakten 36
2.5.2 Quantitative Proteinbestimmung 37
2.5.3 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese 37
2.5.4 Immuno Blot 38
3 Ergebnisse 40
3.1 Systematische Mutagenese des 14.7K Gens 40
3.1.1 Konstruktion der Mutanten des 14.7K Gens 40
3.1.2 Klonierung der Mutanten in den Expressionsvektor pQCXIP
und transiente Produktion von Retroviren 41
3.2 Stabile Transformation des 14.7K Gens in murine NW 3T3 Fibroblas
ten und Analyse der antiapoptotischen Wirkung von 14.7K auf die
TNFR1 und Fas Signalwege 42
3.3 TNF und Fas Ak Zytotoxizitätsassays 42
3.3.1 Sensibilisierung mit Cycloheximid 43
3.3.2 14.7K vermittelte Protektion gegen TNF und Fas Ak induzierte
Apoptose 43
3.4 Herstellung einer FLAG Epitop markierten Mutante F 14.7K 45
3.5 Vergleich der 14.7K Mutanten im Zytotoxizitätsassay mit TNF und Fas
Ak 47
3.5.1 Verlust des antiapoptotischen Effekts gegen TNF und Fas Ak . 47
3.5.2 Verlust des antiapoptotischen Effekts gegen TNF bei erhaltener
Protektion gegen Fas Ak 53
3.5.3 Erhaltung des antiapoptotischen Effekts gegen TNF und Fas Ak 53
3.6 Nachweis der Expression der 14.7K Mutanten in NIH 3T3 Fibroblasten
im Westemblot 56
4 Diskussion 58
4.1 Mutagenese des 14.7K Gens 59
3
4.2 Stabile Transfektion muriner Zellen mit Mutanten von 14.7K 60
4.3 Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays der 14.7K Mutanten 60
4.4 Nachweis der Expression von 14.7K im Westernblot 62
4.5 Funktionelle Proteindomänen von 14.7K 64
4.6 Angriffspunkte von 14.7K bei der Hemmung von TNF und FasL induzierter
Apoptose 65
4.6.1 Die „14.7K interacting proteins" FIPs 66
4.6.2 Modell über die Angriffspunkte von 14.7K im TNFR1 und Fas
Signalweg 66
4.6.3 Ausblick 70
5 Zusammenfassung 71
Abbildungsverzeichnis 81
Tabellenverzeichnis 83
Selbständigkeitserklärung 84
Danksagung 85
Lebenslauf 86
4
Abbildungsverzeichnis
1.1 Induktion der Apoptose durch TNF und FasL 13
1.2 Schematiche Darstellung der wichtigsten Proteine in der E3 Region . 16
1.3 Mögliche Angriffspunkte der adenoviralen Proteine E1B 19K, RID und
14.7K zur Hemmung der durch TNF, FasL und TRAIL induzierten
Apoptose 19
3.1 Die Sequenz des 14.7K Gens und die Stellen des Moü'vaustauschs durch
ein FLAG Epitop 41
3.2 Zytotoxizitätsassay der NIH 3T3 Parental und der NW 3T3 14.7K wt
Zellen bei Behandlung mit TNF 44
3.3 Zytotoxizitätsassay der NIH 3T3 Parental und der NIH 3T3 14.7K wt
Zellen bei Behandlung mit Fas Ak 44
3.4 NIH 3T3 F 14.7K , NIH 3T3 F 14.7K PM und NIH 3T3 14.7K wt Zellen
im Zytotoxizitätsassay bei Behandlung mit TNF 46
3.5 NIH 3T3 F 14.7K , NIH 3T3 F 14.7K PM und NIH 3T3 14.7K wt Zellen
im Zytotoxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak 46
3.6 Übersicht der einzelnen 14.7K Mutanten und deren Resistenz gegen¬
über TNF und Fas Ak vermittelter Apoptose 48
3.7 Mit den 14.7K Mutanten 1,3,4 und 5 transfizierte Zellen im Zytotoxi¬
zitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 49
3.8 Mit den 14.7K Mutanten 6,7,8 und 10 transfizierte Zellen im Zytotoxi¬
zitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 50
3.9 Mit den 14.7K Mutanten 11,12,13 und 14 transfizierte Zellen im Zyto¬
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 51
3.10 Mit den 14.7K Mutanten 15,17,22 und 24 transfizierte Zellen im Zyto¬
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 52
3.11 Mit den 14.7K Mutanten 0, 2, 9 und 23 transfizierte Zellen im Zytoto¬
xizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 54
81
3.12 Mit den 14.7K Mutanten 18,19,20 und 21 transfizierte Zellen im Zyto
toxizitätsassay bei Behandlung mit Fas Ak und TNF 55
3.13 Analyse der 14.7K Expression in HEK 293T und NIH 3T3 ZeUen im
Westernblot 57
3.14 Analyse der 14.7K Expression in HEK 293T und NIH 3T3 ZeUen im
Westemblot 57
4.1 Verhalten der mit 14.7K transfizierten Zellen im Zytotoxizitätsassay im
Vergleich mit den Ergebnissen von Ranheim et al 63
4.2 Funktion der vier bisher identifizierten FIPs und ihre Interaktion mit
anderen zellulären Signalproteinen 67
4.3 Schematische Darstellung möglicher Angriffspunkte von 14.7K zur Hem¬
mung der TNF und der FasL induzierten Apoptose 69
82
Tabellenverzeichnis
2.4 Reaktionsbedingungen der PCR bei Nutzung der Pfu DNA Polymerase 31
2.5 Reaktionsbedingungen der PCR bei Nutzung der Gold DNA Polymerase 31
2.6 URLs der verwendeten Websites 32
2.7 Reaktionsbedingungen bei Mutagenesen mit dem QuikChange Site Directed
Mutagenesis Kit 34
2.8 Standardreihe für die Proteinbestimmung (Kit nach Lowry) 37
2.9 Zusammensetzung der Trenngele für die SDS PAGE 38
2.10 Zusammensetzung des 5 % igen Sammelgels für die SDS PAGE . 38
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| spelling | Lehn, Alexander 1979- Verfasser (DE-588)132759047 aut Struktur- und Funktionsanalyse des Adenovirusproteins E3-14.7K zur Aufklärung funktioneller antiapoptotischer Proteindomänen im FAS- und TNFR1-Apoptose-Signalweg vorgelegt von Alexander Lehn 2006 86 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2006 Adenovirusprotein E3 (DE-588)4320472-7 gnd rswk-swf Apoptosis (DE-588)4291096-1 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Adenovirusprotein E3 (DE-588)4320472-7 s Apoptosis (DE-588)4291096-1 s b DE-604 HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=015496424&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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