Regulation der Insulinsekretion in alpha 2 A - und alpha 2 C - Adrenozeptor- KO - sowie alpha 2 A / C - Adrenozeptor-Doppel-KO -Mäusen:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 10
1. Einleitung
1.1 Das endokrine Pankreas 12
1.2 Aufbau der endokrinen „Inseln des Pankreas 13
1.3 Insulinstruktur, synthese und speicherung 15
1.3.1 Physiologische Stimulation der Insulinsekretion 17
1.3.2 Modulation der Insulinsekretion 20
1.3.3 Hemmung der Insulinsekretion 23
1.4 Adrenerge Rezeptoren 26
1.5 Diabetes mellitus 27
1.6 Transgene Mausmodelle in der Diabetesforschung 29
1.7 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 32
2. Material
2.1 Mäuse und Mausmodelle 35
2.1.1 Black 6 Wildtyp Maus 36
2.1.2 a2A/c AR Doppel KO Maus 36
2.2 Geräte 39
2.3 Chemikalien 39
2.4 Lösungen 41
Inhaltsverzeichnis
2.4.1 Lösungen zur Isolation von DNA aus Gewebeproben der
Maus 41
2.4.1.1 Lysis Puffer 41
2.4.2 PCR Ansätze 42
2.4.2.1 PCR Protokoll O2A AR KO (Kombinationsansatz WT/KO) 42
2.4.2.2 PCR Protokoll a2c AR KO 42
2.4.3 Materialien für Gelelektrophorese 44
2.4.3.1 Agarose Gel 44
2.4.3.2 Probenpuffer 44
2.4.3.3 Laufpuffer 44
2.4.4 Lösungen zur Präparation der Langerhans schen Inseln aus
Mauspankreas 45
2.4.4.1 Hanks Lösung 45
2.4.4.2 Kollagenase Lösung 47
2.4.5 Lösungen zur Inkubation der Langerhans schen Inseln 47
2.4.5.1 Krebs Ringer Puffer (KRB; Krebs Ringer Buffer) 47
2.4.5.2 Testsubstanzen 48
2.4.6 Medium zur Kultivierung der Langerhans schen Inseln 51
2.4.7 Lösungen für die Bestimmung der intrazellulären cAMP
Konzentrationen 51
2.4.7.1 Messungen der Adenylylzylase Aktivität 52
2.4.7.2 Messungen der cAMP Konzentration in Mausinseln 53
2.4.8 Lösungen für die Durchführung des RIA 54
Inhaltsverzeichnis
3. Methoden
3.1 Identifikation der a2A/c AR Doppel KO Mäuse mit Hilfe
der PCR (Polymerase chain reaction) 56
3.1.1 Isolation von DNA aus Gewebeproben der Maus 56
3.1.2 Analyse der DNA Proben mittels PCR 57
3.1.3 Auswertung der PCR Ergebnisse mit Hilfe einer Agarose
Gelelektrophorese 58
3.2 Messung der Insulinsekretion der Langerhans schen Inseln
der Maus 59
3.2.1 Isolation der Langerhans schen Inseln aus dem Mauspankreas 59
3.2.2 Vorinkubation der Langerhans schen Inseln 61
3.2.3 Inkubation der endokrinen Inseln in Anwesenheit der
Testsubstanzen 61
3.2.4 Kultivierung der endokrinen Inseln über Nacht 62
3.3 Analyse der Adenylylzyklase Aktivität 63
3.3.1 Messung der Adenylylzyklase Aktivität in Inselzellhomogenaten 64
3.3.2 Messung der cAMP Konzentration in kultivierten Inseln 65
3.4 Verfahren zur Quantifizierung von Insulin und cAMP 66
3.4.1 Radio Immuno Assay (RIA) 66
3.4.2 Enzyme Immuno Assay (EIA) 68
3.5 Auswertung und Darstellung der Ergebnisse 69
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse
4.1 Identifikation der a2A/c AR Doppel KO Mäuse mittels PCR 70
4.2 Adrenerge Hemmung der Insulinsekretion in cfe AR KO
Mäusen 74
4.2.1 Regulation der Insulinsekretion in frisch isolierten Inseln von
a2 AR KO Mäusen 74
4.2.1.1 Glucose induzierte Stimulation der Insulinsekretion und ihre
Hemmung durch Adrenalin in frisch isolierten cfcc AR KO
Inseln 74
4.2.1.2 Glucose induzierte Stimulation der Insulinsekretion und ihre
Hemmung durch Adrenalin in frisch isolierten O2A AR KO
Inseln 76
4.2.1.3 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in frisch
isolierten (J2a AR KO , a2c AR KO und Wild Typ Inseln
im Vergleich 77
4.2.1.4 Insulingehalte der frisch isolierten Inseln von c(2a AR KO ,
a2c AR KO und Wild Typ Mäusen 79
4.2.2 Regulation der Insulinsekretion in kultivierten Inseln von 02
AR KO Mäusen in An und Abwesenheit von PTX 81
4.2.2.1 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in kultivierten
Inseln von a^ AR KO , a2C AR KO und Wild Typ Mäusen
mit und ohne PTX 81
4.2.2.2 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in kultivierten
Inseln von a2A/c AR Doppel KO und Wild Typ Mäusen mit
und ohne PTX 87
i
Inhaltsverzeichnis
4.2.2.3 Insulingehalte in kultivierten Inseln von ci2A AR KO , C(2c AR
KO , CJ2A/C AR Doppel KO und Wild Typ Mäusen mit und
ohne PTX 90
4.3 Analyse der Adenylylzyklase Aktivität in a2 AR KO
und WT Maus Inseln 92
4.3.1 Adenylylzyklase Aktivität in Inselhomogenaten 92
4.3.2 Adenylylzyklase Aktivität in kultivierten Inseln 94
5. Diskussion
5.1 KO Mäuse 98
5.1.1 Q2 AR KO Mäuse 99
5.2 Stimulation der Insulinsekretion 100
5.3 Hemmung der Insulinsekretion 102
5.4 Kopplung der a2 AR Subtypen an PTX sensitive
G Proteine 103
5.5 Hemmung der Adenylylzyklase Aktivität 105
5.6 Bedeutung der a2 AR Subtypen für die Regulation der
Insulinsekretion 106
6. Zusammenfassung 112
7. Literaturverzeichnis 114
8. Vorabveröffentlichungen 129
9. Lebenslauf 130
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 10
1. Einleitung
1.1 Das endokrine Pankreas 12
1.2 Aufbau der endokrinen „Inseln" des Pankreas 13
1.3 Insulinstruktur, synthese und speicherung 15
1.3.1 Physiologische Stimulation der Insulinsekretion 17
1.3.2 Modulation der Insulinsekretion 20
1.3.3 Hemmung der Insulinsekretion 23
1.4 Adrenerge Rezeptoren 26
1.5 Diabetes mellitus 27
1.6 Transgene Mausmodelle in der Diabetesforschung 29
1.7 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 32
2. Material
2.1 Mäuse und Mausmodelle 35
2.1.1 Black 6 Wildtyp Maus 36
2.1.2 a2A/c AR Doppel KO Maus 36
2.2 Geräte 39
2.3 Chemikalien 39
2.4 Lösungen 41
Inhaltsverzeichnis
2.4.1 Lösungen zur Isolation von DNA aus Gewebeproben der
Maus 41
2.4.1.1 Lysis Puffer 41
2.4.2 PCR Ansätze 42
2.4.2.1 PCR Protokoll O2A AR KO (Kombinationsansatz WT/KO) 42
2.4.2.2 PCR Protokoll a2c AR KO 42
2.4.3 Materialien für Gelelektrophorese 44
2.4.3.1 Agarose Gel 44
2.4.3.2 Probenpuffer 44
2.4.3.3 Laufpuffer 44
2.4.4 Lösungen zur Präparation der Langerhans'schen Inseln aus
Mauspankreas 45
2.4.4.1 Hanks Lösung 45
2.4.4.2 Kollagenase Lösung 47
2.4.5 Lösungen zur Inkubation der Langerhans'schen Inseln 47
2.4.5.1 Krebs Ringer Puffer (KRB; Krebs Ringer Buffer) 47
2.4.5.2 Testsubstanzen 48
2.4.6 Medium zur Kultivierung der Langerhans'schen Inseln 51
2.4.7 Lösungen für die Bestimmung der intrazellulären cAMP
Konzentrationen 51
2.4.7.1 Messungen der Adenylylzylase Aktivität 52
2.4.7.2 Messungen der cAMP Konzentration in Mausinseln 53
2.4.8 Lösungen für die Durchführung des RIA 54
Inhaltsverzeichnis
3. Methoden
3.1 Identifikation der a2A/c AR Doppel KO Mäuse mit Hilfe
der PCR (Polymerase chain reaction) 56
3.1.1 Isolation von DNA aus Gewebeproben der Maus 56
3.1.2 Analyse der DNA Proben mittels PCR 57
3.1.3 Auswertung der PCR Ergebnisse mit Hilfe einer Agarose
Gelelektrophorese 58
3.2 Messung der Insulinsekretion der Langerhans'schen Inseln
der Maus 59
3.2.1 Isolation der Langerhans'schen Inseln aus dem Mauspankreas 59
3.2.2 Vorinkubation der Langerhans'schen Inseln 61
3.2.3 Inkubation der endokrinen Inseln in Anwesenheit der
Testsubstanzen 61
3.2.4 Kultivierung der endokrinen Inseln über Nacht 62
3.3 Analyse der Adenylylzyklase Aktivität 63
3.3.1 Messung der Adenylylzyklase Aktivität in Inselzellhomogenaten 64
3.3.2 Messung der cAMP Konzentration in kultivierten Inseln 65
3.4 Verfahren zur Quantifizierung von Insulin und cAMP 66
3.4.1 Radio Immuno Assay (RIA) 66
3.4.2 Enzyme Immuno Assay (EIA) 68
3.5 Auswertung und Darstellung der Ergebnisse 69
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse
4.1 Identifikation der a2A/c AR Doppel KO Mäuse mittels PCR 70
4.2 Adrenerge Hemmung der Insulinsekretion in cfe AR KO
Mäusen 74
4.2.1 Regulation der Insulinsekretion in frisch isolierten Inseln von
a2 AR KO Mäusen 74
4.2.1.1 Glucose induzierte Stimulation der Insulinsekretion und ihre
Hemmung durch Adrenalin in frisch isolierten cfcc AR KO
Inseln 74
4.2.1.2 Glucose induzierte Stimulation der Insulinsekretion und ihre
Hemmung durch Adrenalin in frisch isolierten O2A AR KO
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4.2.1.3 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in frisch
isolierten (J2a AR KO , a2c AR KO und Wild Typ Inseln
im Vergleich 77
4.2.1.4 Insulingehalte der frisch isolierten Inseln von c(2a AR KO ,
a2c AR KO und Wild Typ Mäusen 79
4.2.2 Regulation der Insulinsekretion in kultivierten Inseln von 02
AR KO Mäusen in An und Abwesenheit von PTX 81
4.2.2.1 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in kultivierten
Inseln von a^ AR KO , a2C AR KO und Wild Typ Mäusen
mit und ohne PTX 81
4.2.2.2 Stimulation und Hemmung der Insulinsekretion in kultivierten
Inseln von a2A/c AR Doppel KO und Wild Typ Mäusen mit
und ohne PTX 87
i
Inhaltsverzeichnis
4.2.2.3 Insulingehalte in kultivierten Inseln von ci2A AR KO , C(2c AR
KO , CJ2A/C AR Doppel KO und Wild Typ Mäusen mit und
ohne PTX 90
4.3 Analyse der Adenylylzyklase Aktivität in a2 AR KO
und WT Maus Inseln 92
4.3.1 Adenylylzyklase Aktivität in Inselhomogenaten 92
4.3.2 Adenylylzyklase Aktivität in kultivierten Inseln 94
5. Diskussion
5.1 KO Mäuse 98
5.1.1 Q2 AR KO Mäuse 99
5.2 Stimulation der Insulinsekretion 100
5.3 Hemmung der Insulinsekretion 102
5.4 Kopplung der a2 AR Subtypen an PTX sensitive
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5.5 Hemmung der Adenylylzyklase Aktivität 105
5.6 Bedeutung der a2 AR Subtypen für die Regulation der
Insulinsekretion 106
6. Zusammenfassung 112
7. Literaturverzeichnis 114
8. Vorabveröffentlichungen 129
9. Lebenslauf 130 |
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